Молекулярная биология гена - Уотсон Дж.
Скачать (прямая ссылка):
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НУКЛЕОТИДОВ В КОДОНАХ ПО СПЕЦИФИЧЕСКОМУ СВЯЗЫВАНИЮ СООТВЕТСТВУЮЩИХ тРНК
В 1964 г. был разработан примой метод для определения последовательности нуклеотидов в некоторых кодонах. Этот метод основывается на том, что комплексы мРНК—рибосома могут связывать молеку лы тРНК в отсутствие белкового сиптеча. Например, при смешении полн(5>) с рибосомами образовавшийся комплекс будет присоединять только феинлалани-иовую тРНК. Соответственно связывание по1и(Ц) с рибосомой стимула рует присоединение проишовои тРНК Наиболее важно в атом феномене то, что для такого специфического связывания тРНК не требуется щшелт ствия длинных цепей мРИК: достаточно взаимодействия рибосомы с соот ветствующим тринуклеотидом. Добавление к рибосоме тринуклсотнда УЪ Ъ обеспечивает специфическое связывание фенилалапиновои тРНК, а добавление трипукпеотида ААА — связывание лизиновой тРНК Обнаружение зтого эффекта открыло путь для относительно легкого определе пня пос ледовательности нуклеотидов во многих кодонах До этого открытия ка эалось очевидным, что такое определение пе удастся провести до те\ нор, пока химики-органики ие научатся синтезировать длинные полинуклеотиды с регулярно повторяющимися последовательпостямп. Но теперь стало ясно, что использование трниуктеотидов с известной последова тель постью оснований дает возможность установить последовательность нуклеотидов во многих кодонах Выяснилось папример, что трипу к леотиды 61ГУУ3', 5'УГУ3' и б'УУГ3' стимулируют присоединение соответственно Вс?линовой, цистеиновой и лейцнновон тРНК. В резучьтате интенсивной р аботьт были синтезированы все возможные 64 триплета в надежде на то, что с их помощью удастся расшифровать послед овательиость в большли-
Таблица 13-3 Связывание специфической тГНК комплексом трину клеотнд—рноос ома
Трвнуилготит Связываемая тРНК
6’УУУ3' УУЦ Фены ла лав иновая
ууа ЬУГ ЦУУ ЦУЦ ЦУЛ ЦУГ Леицнновая
ААУ АУЦ АУА Изолеицныоиая
АУГ Метиониновая
ГУУ ГУЦ ГУА ГУГ УЦУ Валижшая
УЦУ УЦЦ УЦА УЦГ Сернновая
ццъ ццц ЦЦА ццг Прочиновая
ААА ЛАГ Лизнновая
УГУ У1Ц Цнгте«новая
I АА 1АГ тРНК х’ «утаьшновоп
стве кодонов. В табл 13-3 приведепы некоторые кодоны, установленные таким путем- Следует, однако, отметить, что этим методом, видимо, невозможно определить все правильные комбинации, так как некоторые трн-иуклеотиды связываются с тРНК значительно меиее эффективпо, чем УУУ или ГУУ, и это не позволяет решить, кодируют они какую-либо аминокислоту или пет.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НУКЛЕОТИДОВ В КОДОНАХ С ПОМОЩЬЮ РЕГУЛЯРНЫХ СОПОЛИМЕРОВ
Одновременно с описанным выше методом был предложен и еще один метод расшифровки кодонов. Он основан па использовании синтетических полирпбонуклеотидов с известными повторяющимися последовательностями, которые удалось приготовить благодаря комбинированшо методов органического и ферментативного синтеза. Эти регулярные сополимеры обеспечивают специфическое включение амипокислот в полипептиды- Выяснилось, например, что повторяющаяся последовательность ЦУЦУЦУЦУ действует, как мТ’НК для сиптеза регулярного полипептида, в котором чередуются аминокислоты леицнк и серии, последовательность УГУГУГ стимулирует синтез полипептида, содержащего аминокислоты цистеин и валин, а полимер АЦЛЦАЦ... направляет синтез полннептида из чередующихся аминокислот треонина и гистидина (табл 13 4). Использование в качестве матрицы сополимера, построен
Таблиц» 13-4 Определение последовательности нуклеотидов в кодонах с лимонило регулярных сополимсрон, построенных из дп> х разных основании
Сополимер Вк-иочеита1 аминокислот Кодон
ЦУЦ ' УЦУ | ЦУЦ . . Лспцтш 5 'ЦУЦЗ-
Серии УЦУ
УГУ | ГУГ ] УГУ - . Цистеин УГУ
Валин ГУГ
АЦА | ЦАЦ | АДА Треонин АЦА
Гиг тидин ЦАЦ
АГА | ГАГ 1 АГА . Аргиннп АГА
Глутамин ГАГ
Таблица 13-5 Определение иосш-юштслыюсти нуклеотидов в кодонах с помощью полимеров, состоящих из повторяющихся тринуКЛСОТИДОЯ
Сополимер Считываемый колон Образующийся полипептид Коз и
(АЛГ)п ААГ 1 ААГ 1 ААГ - Полилизин Ь ААГ^
АГА АГА | АГА - Поп пар гини н АГА
ГАА | ГАА | ГАА . - Поли глутаминовая кислота ГАД
(УУ'Ц)„ УУЦ УУЦ | УУЦ • - Нолифспнлалашш УУП
УЦУ 1 УЦУ 1 УЦУ . - Полиссрии УЦХ
ЦУУ1ЦУУ|ЦУУ- . - Полили ЩИН ЦУ>
(УУГ)П УУГ |УУГ | УУГ - • Полилейцин УУ1
УГУ 1 УГУ I УГУ - Полицистеин
ГУУ1ГУУ|ГУУ Поливалин ГУУ
