Молекулярная биология гена - Уотсон Дж.
Скачать (прямая ссылка):
В БЕСКЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМАХ МОЖНО СИНТЕЗИРОВАТЬ ОПРЕДЕЛЕННЫЕ БЕЛКИ
В наших беек неточных системах даже при добавлении избытка мРНК лишь небольшое количество аминокислот включается в полинеихидпые цепи. Очевидно, мы еще не умеем надлежащим образом воспроизводить те условия. в которых протекает нормальный синтез белка in vivo. Вначале высказывались даже сомнения, действительно ли белки, синтезированные in vUro, имеют такую же структуру, как и природные белки К счастью, благодаря использованию специфических вирусных ГНК эти сомнения были расгеяны; удалось показать, что и в бесклеточных системах код считывается правильно. В первых удачных опытах, проведенных в 1962 г., к предварительно инкуби]юванному экстракту Е coh добавляли PIIK, выделенную из бактериофаг F2. Она действовала как матрица и стиму-
лировала включение аминокислот в белок. Некоторые полипептидные цепи оказались в конечном счете достроенными и отделились от рибосом Эти новообразованные белки сравнили с белком оболочки F2, имеющим мол. вес 14 ООО. Сравнение показало, что некоторая часть белков имела ту же последовательность аминокислот, что и белок F2, синтезированный in vivo. Отсюда следует, что в условиях бес клеточной системы молекулы мРНК способны правильно выбирать предшественники (АА —• тРИК) для построения полипептидной цепи
Множество других вирусных и клеточных белков удалось синтезировать в бесклеточыых системах в течение следующего десятилетия Одним из первых успешных синтезов был синтез лизоцима фага Т4, фермента (мол. вес 20 ООО), который способствует разрушению клеточных стенок бактерий. Осуществление синтеза этого фермента в активпой форме еще раз поназало, что трансляция в системах in vitro происходит с большой точностью. После непродолжительного периода, в течение которого исследователи сталкивались с трудностями при синтезе очень длинных поли-пептидных цепей, уже в 1969 г. было убедительно продемонстрировано, что в бесклеточной системе можно синтезировать ферментативно активную р-галактозидазу, состоящую из 1300 аминокислот. Более того, за последнее время в бесклеточных системах был синтезирован цетый ряд важных белков млекопитающих (например, гемоглобин, легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов, актин, коллагеи и миозин); все это показывает, что условия синтеза in vitro для белков высших организмов изучены в настоящее время так же хорошо, как и условия синтеза бактериальных белков
СТИМУЛЯЦИЯ ВКЛЮЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ СИНТЕТИЧЕСКИМИ мРНК
Хотя описаипые выше опыты с вирусной РНК и доказали, что в бесклеточ-пых системах сохраняется правильное считывание генетического кода, все же сами по себе эти опыты еще ничего не дали для выяснения точной природы кода. Иными словами, они по дали возможности установить, какие тройки нуклеотидов кодируют те или ипыс амииокисчоты (напом-
Таблица 13-1 64 возможных трехбуквенных кодона
Первое Второе положение Третье
У Ц А Г j юложение
(3' -конец)
У УУУ УЦУ УАУ УГУ У
УУЦ УЦЦ УАЦ УГЦ Ц
УУА УЦА УАА УГА А
УУГ УЦГ УАГ УГГ Г
Ц ЦУУ ЦЦУ ЦАУ ТДГУ У
ЦУТД ЦТЩ ЦАЦ ТДГЦ У
ЦУА ЦЦА Ц\А ЦГА А
ЦУГ ЦЦГ ЦАГ цгг Г
А АУУ АЦУ ААУ АГУ У
АУЦ АЦЦ ААЦ АГЦ Ц
АУА АЦА ААА АГА А
АУГ АЦГ ААГ АГГ Г
Г ГУУ ГЦУ ГАУ ГГУ У
ГУЦ ЩЦ ГАД ГГЦ Ц
ГУА ГЦА ГАА ГГА А
ГУГ ГЦГ ГАГ ггг Г
©~©--н
+
(ф)— Рибоза — | А тенин [
— Рибоза — | Л jemin~| (^) — Рибоза — | Аденин |
— Риб012 — | \ ЧСИИ11~|
Рибоза.— | Адеит»~]
(Оу — Рибоза — j Д-гении | \
— Рибоза — [ A.миин]
+ ©
П олин^клеотндф otф при та 1 а
Рис 13-3. Синтез (и расиад) Р НК иод действием фермента полинуклеотидфосфорилазы.
ним, что таких троек, или триплетов, может быть 64, поскольку имеется
4 типа нуклеотидов; табл. 13-1).
Дчя получения необходимых данных были использованы синтетические полирибонуклеотиды. Их приготовляют с помощью фермента пол инукле отидфосфо рилазы. Отот фермент, найденный у всех бактерий, катализирует следуютц>ю реакцию:
(РНК) -f-@ Рибоиуклеозид—@ (13-1)
В нормальных для клетки условиях равновесие реакции сдвинуто в сторон\ распада PIIK до нуклеозиддифосфатов, так что г-тавиая функ дня полипуклеотидфосфорилазы, возможно, заключается в том чтобы контролировать время жизни mL'HK (гл. М) Однако, используя высокие начальные концентрации нуклеозиддифосфатов можно сдвинуть равновесие в сторону образования 3‘,5'-фоефодиэфирной связи (рис. 13-3), что приведет к образованию синтетических РНК Так как полинуклеотид фосфорилаза не является биосинтетическим формеитом для синтеза не требуется матричной Р НК, и состав продуктов реакции полностью определяется концентрациями различных дифосфатов в реакционной смеси Если, например, в смеси присутствует только АДФ, то в составе продукта реакции обнаруживается только адениловая кислота, такой продукт называется иолиадениловой кислотой или сокращенно ноли(А). Тем же способом можно синтезировать поли(У), шли(Ц) н поди(Г). Гели в реакци о иной смеси присутствует два разных дифосфата или более, то образуются сополимеры, например поли(АУ), поли(АЦ), поли(ЦУ) или поли(АГЦУ) Во всех зтих смешанных полимерах последовательность основании имеет случайный характер и частота различных динуклеотидов (частота ближайших соседей) определяется только относительными концентрациями исходных реагентов Так, если концентрация А в 2 раза больше концентрации У, то носчедовательпость оснований в поли(АУ) может иметь следующий вид. УААУАУАААУААУААААУАУУ и т- д.
