Молекулярная биология гена - Уотсон Дж.
Скачать (прямая ссылка):
Чтобы избавиться от этой трудности, исследователи обратились к другой гипотезе, согласно которой рекомбинация связана с процессом репликации хромосомы. Предполагается, что в процессе репликации спаренных хромосом новая цепь ДНК сначала строится вдоль одной хромосомы, т. е. копирует, на пример, отцовскую хромосому, а затем синтез переключается на материнскую хромосому, н в дальнейшем копируется уже эта последняя. Если в той же точке происходит и переключение синтеза второй цени (па этот раз с материнской хромосомы на отцовскую), то в результате должны образоваться две реципрокные рекомби пантные цени. Этот гипотетический процесс получил па звание копирования с переменой матриц Фундаментальное различие между двумя гипотезами проявляется, когда мы пытаемся решить вопрос о физическом происхождении материала рекомбинаитпых хромосом. Согласно гипотезе разрыва и воссоединения, рекомбинантные хромосомы состоят из мате-
А PaipbiB и воссоединение
{.Си фиванис и скручивание 2 Разрыв двух хроматиц
Ь Копирование с переменой матриц
3 Перекрестное яоисое 4 Про 1ук1ы перекрест-динение разогнанных кого воссоединении хромат ид
t Синтез новых хрома]ил
2 Переключение на копирование другой
хроматиды
4 Продукты копирования с переменой матриц
Рнс 10-9. Схематическое изображение двух возможных механизмов кроссииговера.
ДНК инфицирующего фага
rf-Л.
Тяжелый фаг Q Легкий ф
С ГСН1)! ИНОМ С ГСНОШЦО'
ABC Лч яЬс
Дочерние молекулы Гибридные Легкие
Легкие частицы (таких большинство) располагаются в этой зоне
Немногие частицы располагают! в зоне большей плоте
Классы рекомбинантов
Распределение дочериик частиц но плотности после центрифугирования в растворе CsCl
Цепь легкой ДНК *— Цепь тяжелой ЛНК 9Р Дочерние частицы, содержа' шие только легкие атомы
Рис. 10-10. Изучение механизма кроссинговера с помощью тяжелых изотоиов. Бактерии, растущие в легкой среде, инфицируются тяжелым фагом с генотипом ABC и легким фагом с генотипом abc. Фаговая ДИК, проникнув к клетки, реплицируется, в результате чего почти все родительские цепи оказываются в составе гибридных или легких молекул. Однако многие родительские цепи не остаются интактными, так как они вовлекаются в кроссинговер. В этом можно убедиться.
! Молекулы CsCl
наблюдая распределение дочерних фаговых частиц в градиенте плотности CsCl. Основная масса частиц не содержит тяжелых изотоиов Эти частицы занимают верхнюю часть про бирки. Некоторые частицы образуют полосу в зоне большей плотности, потому что они содержат тяжелые атомы, полученные о? родителя АБС. Рекомбинанты с генотиш АБс располагаются ниже, чем рекомбинанте с генотяпом аЬС.
риала двух родительских хромосом; в случае копировании с переменой матриц они синтезируются только из нового материала.
Эти две гипотезы были проверены экспериментально с иомогцыо фага X, меченного тяжелыми изотопами (1SC, 16N) (рис. 10-10, 40-14). В этих опытах тяжелые изотопы служили для различения родительских и дочерних цепей ДИК при центрифугировании в градиенте плотности CsCl. Генетические скрещивания между тяжелыми (или между тяжелыми и легкими) частицами фага осуществлялись в клетках Е. coli, растущих на легкой среде (13С и 14N). В этих условиях вся иовосинтезированная фаговая ДНК должна была содержать легкие изотопы; следовательно, если копирование действительно происходит с переменой матриц, то всо рекомбипаптные частицы могли быть только легкими. Если же рекомбинанты образуются путем разрыва и воссоединения, то некоторые рекомбинантные фаговые частицы долиты были содержать тяжелые атомы, полученные от родительских хромосом. Потомство фага, полученное от этих скрещиваний, помещали в концентрированные растворы хлористого цезия и подвергали равновесному центрифугированию для разделения частиц но плотности. После этого фаговые частицы различной «лот-пости исследовали генетически, чтобы выявить, какие из них являются рекомбинантными. Эксперименты дали отчетливые результаты (рис. 10-10) и ко всеобщему удивлению показали, что некоторые рекомбинантные частицы содержат тяжелые атомы.
ДНК инфицирующего фаг
- Цеп. “• Цсш
легкой ДНК тяжелой ДИК сулы CsCj
-op Дочерние частицы, содержащие юлько легкие атомы
Рис. 10-11. Экспериментальное доказательство юго факта, что кроссиш опер и репликация ДНК представляют собой два независимых процесса.
Легкие бактерии, растущие в легкой среде, инфицируются несколькими частицами тяжелого фага с генотипом АВ и несколькими частицами тяжелого фага с генотипом аЬ. После проникновения в клетку почти все тяжелые цепи оказываются в составе гибридных молекул Однако в некоторых (редких) случаях репликация по какой-то причине ие щюисхо дит и при созревании в белковую оболочку включается сама инфицирующая молекула. Этот феномен но позволяет нам решить, явля-
ются ли редкие тяжелые молекулы ДНК истинными рекомбинантами. Потомство фагон исследуют затем в градиенте плотности СеС1. Большинство дочерних частиц не содержит тяжелой метки и располагается в зоне наименьшей плотности. В самой пижией зоне располагаются очень редкие частицы, содержащие полностью тяжелые молекулы ДНК. Некоторые из этих частиц являются реком, бипантами классов АЬ и аВ. Из этого следует-что кроссинговер может происходить между интактпыми двухцепочечными молекулами ДНК и что интенсивный синтез ДНК для иего вовсе ие обязателен.
