Молекулярная биология гена - Уотсон Дж.
Скачать (прямая ссылка):
I
Нукчеазный разрыв петли
Одноцепочечный хвост с неполном петлей в виде шпильки на ч- конце
С вязы вяние с д руктурны х банков фага с удлиняю-Мест возмоаного щимся хвостом
Переход в кольцевую форм} путем образования пашой иепи
Замыкание ко 1ьца лигазой
Рис. 9-33. Образование одноцепочечной ДНК по механизму катящегося кольца.
Показаны реакции, которые, как считается, участвуют в образовании одноцепочечных кольцевых ДНК. подобных ДИК фагов ФХ174 и Id.
Репликация- ДНК
Рис 9-34 Перенос одноцепочечной ДНК от Шорной бактертш в решшпентную по механизму катящегося кольца.
деленной цепи хромосомы мужской клетки образуется одноцепочечпый разрыв Затем 3'-конец этой цепи удлиняется, что приводит к вытеснению 5'-конца и увеличению ого длины По всей вероятности, фермент, который производит специфическое разрезание, подобно ферменту, начинающему синтез на катящемся кольце, остается прикреплешшм к 5'-копцу н направляет его каким-то образом в реципиентную клетку (рнс 9-34). Как только ДНК донорной клетки оказывается в реципиентнои клетке ома превращается в нормальную двухцепочечную ДИК. Затем она может путем генетической рекомбинации заменить часть хромосомы женской клетки. Благодаря этому механизму переноса, связывающему по ювой процесс с репликацией ДНК, исключается образование генетически дефектных мужских клеток
МУТАЦИИ, БЛОКИРУЮЩИЕ СИНТЕЗ ДНК
Во многих местах хромосомы F. coli бычи обнаружены мутации, специфически блокирующие синтез ДНК (рис. 9-35). Некоторые из этих мутаций (dna A, dna С) специфически блокируют возникновение новых репликативных вилок, по не влияют па рост предсуществующих виток. Другие мутации приводят к быстрому прекращению синтеза в прсдсу-ществующих репликативных вилках из-за утраты способности к инициации новых мелких фрагментов (например, dna G) или из-за отсутствия ферментов, непосредственно участвующих в полимеризации (dna Е = - Пол III). Конечно, некоторые из генов, в которых выявлены эти мутации, направляют синтез белков, участвующих в образовании РНК-затравок Были также обнаружены мутации, блокирующие способность к поли меризации ДНК-полимеразн I (11олТ) и II (Пол II), а также активность ДНК-лигазы, сшивающей концы цепей Благодаря этим мутациям синтез не останавливается, во возникает огромное количество песшлтых фрагментов ДНК. По-видимому, имеются и другие гены, кодирующие ферменты репликации, однако у нас нет пока прямых данных, свидетельствующих об их существовании. Например, реакция связывания ДНК-полымеразы III с ДНК нуждается в АТФ, и это предполагает наличие еще неизвестного этапа, предшествующего полимеризации, для которого требуется энергия.
dnaC—D* rnulT
Отсчетиые аокусы I hr, Ion A, gal, trp, aro I), his, ctr thy A. ilv и mnl B-
Phc- 0-35. Расположение гепов, участвующих в репликации, на хромосоме Е. coli {более подробная карта приведена на рис. 7-13,
Л Корнбсрг. Синтез ДНК, «Мир», М., 1977)
РЕПЛИКАЦИЯ ПОЛНЫХ ДВУХЦЕПОЧЕЧНЫХ МОЛЕКУЛ В ПРОБИРКЕ
Если вначале биохимики были счастливы, когда просто обнаруживали какое-то включение нуклеотидов в ДЫК-подобные молекулы, то теперь их требования к экспериментаи in vitro сильно возросли. Оли ие только ищут системы, в которых синтез ДНК идет быстро, но и стремятся найти условия, наиболее близко соответствующие условиям синтеза ДИК ш vivo. Конечной целью является, очевидно, синтез полных молекул ДНК, а не просто присоединение нуклеотидов к растущим цепям с неизвестной структурой. Теперь, после ряда успехов, найдены условия, имитирующие условия в растущих клетках. Синтез ДНК в бссклеточных экстрактах не только идет с большой скоростью, но полученные продукты неотличимы от молекул ДНК, образованных внутри клеток. Б экстрактах, приготовленных из клеток Е. colit исследователям удается синтезировать полные линейные молекулы, достигающие длины ДИК фага Т7, а также просодии, полную полукопсервативную репликацию кольцевой плаз-мидной ДНК. Б последнем случае репликативные пузыри инициируются in vitro в rex же местах, которые in vivo используются как начало репликации, и ©-структуры растут до завершения репликации и разделения кольцевых двухцепочечных молекул. Важно отметить, что дочерние кольца могут служить матрицами для последующих циклов полу консервативной репликации. Можно надеяться, что экстракты, необходимы® для репликации in vitro, удастся вскоре расфр акционировать, для того чтобы выяснить природу каящого фермента, участвующего в процессе репликации, и механизм его действия. Только тогда пока еще спекулятивные идеи о репликации ДНК будут заменены точным описанием работы ферментов.
В настоящее время изучаются условия превращения одноцепо-чечпой ДНК вирусов вроде $6X174 и М13 в соответствующие двухцепочечные репликативные промежуточные структуры in vitro. Неожиданно оказалось, что ферменты, участвующие в превращении одно цепочечной ДНК <?Х174 в двухцепочечпую репликативную форму, сильно отличаются от ферментов, участвующих в формировании двухцепочечпых ДИК ЛИЗ. В частности, несколько бактериальных «гепов репликации ДИК» необходимы для репликации «рХ174, но по нужны для репликации М13 (табл. 9-6). Более а ого, для образования РНК-затравок фага М13 используется РНК полимераза, но в синтезе затравок в фаге <]>Х174 участвует какой-то другой фермент (или ферменты). Поскольку ингибитор РНК-полиме-рааы рифампицин подавляет репликацию плазмиды, но не основной бактериальной хромосомы, создается впечатление, что фаг М13 использует
