Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 6

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 2 3 4 5 < 6 > 7 8 9 10 11 12 .. 171 >> Следующая

котором оба макроиона обладают постоянным суммарным отрицательным зарядом
и мигрируют с постоянными скоростями (в отсутствие дифференцированных
молекулярно-ситовых эффектов антиконвекционной среды разделения). В ходе
фракционирования зоны, диффундируют. В случае ИЭФ белки мигрируют с
постоянно убывающей скоростью по направлению к стационарным зонам
нулевого заряда (pH^pI). (С любезного разрешения фирмы LKB Produkter АВ.)
ставляет -3 и - 1 соответственно. По мере продвижения обоих компонентов
от точки нанесения к аноду компонент А будет постоянно опережать Б. В то
же время обе зоны в ходе электрофореза будут уширяться, поскольку в
данной системе ничто не противодействует тепловой диффузий макромолекул.
При обычном электрофорезе стационарное состояние в принципе недостижимо и
процесс разделения необходимо прервать в какой-то момент прежде, чем
произойдет элюция мигрирующих компонентов в анодную камеру.
При ИЭФ, напротив, устанавливается стабильный градиент увеличения pH в
направлении от анода к катоду, формирующийся за счет электрофоретической
"сортировки" амфолитов-носителей в подходящей антиконвекционной жидкой
среде. Попадая в такую систему, белки или иные амфотерные молекулы:
начинают мигрировать в электрическом поле опять-таки в соответствии со
своими значениями поверхностного заряда. Так, если некая молекула на
данном участке градиента при данном' значении pH заряжена положительно,
то она будет' мигрировать к катоду, т..е. в сторону увеличения pH. По
мере такого-продвижения положительный заряд этой молекулы будет
уменьшаться, а отрицательный возрастать, например за счет
депротонирования аминогрупп и карбоксилов. В итоге молекула достигнет
такой зоны, где ее электрический, заряд окажется рав-
2*
* 30 Глава 1
/ :----------------------------------------------------------
ным нулю, т. е. зоны с pH, равным pi , этой молекулы. Следовательно, в
процессе ИЭФ скорость миграции белка по--стоянно уменьшается, поскольку
его суммарный поверхностный заряд, соответствующий положению равновесия
протонирования-депротонирования (которое в каждой точке определяется
кривой титрования данного белка), также уменьшается, стремясь к нулю. В
конце концов миграция белковой молекулы полностью прекращается. Как
только молекула случайно выйдет за пределы зоны pi, она тотчас приобретет
отличный от нуля заряд и вынуждена будет вернуться к равновесному
положению. Таким образом, электрическое поле прямо, противодействует
диффузии, и при соответствующих условиях белки или иные амфотерные
макромолекулы достигают своего равновесного положения, вблизи которого
они концентрируются в виде необычайно узких зон. Как и следовало ожидать,
разделение двух змфолитов, помимо всего прочего, определяется крутизной
градиента pH, в котором происходит фокусирование. При данной геометрии
разделительной колонки (при неизменной длине пути) разрешение тем выше,
чем положе градиент (см. рис. 1.4).
pH/pi
Рис. 1.4, Разделение амфолитов в зависимости от крутизны градиента pH. В
крутом градиенте pH (пунктирная линия А) два типа амфотерных молекул с
изоточками pli и р12 расходятся лишь на небольшое расстояние (а). В более
пологом градиенте pH (сплошная линия Б) разрешение значительно выше
(расстояние б). (С любезного разрешения LKB Produkter АВ.)
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
21
Рис. 1.5. Эффект фокусирования, или конденсирования, при ИЭФ. Один и тот
же белок (Б, pi = 8,0) вносят в гель с предварительно сфокусированным
градиентом pH двумя порциями -у катода (зона отрицательного заряда) и у
анода (зона положительного заряда для данного белка). Обе исходные зоны
будут мигрировать навстречу друг другу и в итоге конденсироваться, или
фокусироваться, в виде одной зоны нулевого заряда и нулевой подвижности.
Справа приведена кривая зависимости подвижности (заряда) белка от pH
среды. (С любезного разрешения LKB Produkter АВ.)
В дальнейшем это положение будет рассмотрено более обстоятельно (разд.
1.5.7).
Явление "фокусирования", или "конденсирования", в изоточке
проиллюстрировано на рис. 1.5. После внесения одного и того же белкового
иона (р1=8) в заранее сформированный градиент pH в виде двух зон - со
стороны катода (при рН9) и со стороны анода (при рН5) - эти зоны
приобретут заряды противоположного знака, т. е. отрицательный и
положительный соответственно. Это приведет к их встречной миграции вплоть
до полного слияния в одну зону, содержащую белковые молекулы -с нулевым
суммарным зарядом и нулевой подвижностью (рН = р1 = 8). В этой
стационарной зоне достигается динамическое равновесие между тепловой
диффузией и электрофоретической миграцией по направлению к изоточке.
Изначально ИЭФ было разработано как препаративный метод. Фракционирование
проводили в градиенте плотности раствора сахарозы, который служил
антиконвекционной средой, стабилизирующей градиент pH и сфокусированные
белковые зоны. Эксперименты обычно выполняли в колонках объемом 110 или
Предыдущая << 1 .. 2 3 4 5 < 6 > 7 8 9 10 11 12 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed