Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
препаративного фракционирования, характерны искажения, связанные с
электроосмосом, параболическим профилем ламинарного течения и конвекцией,
вызванной неравномерным выделением тепла. Для сведения этих искажений к
минимуму была разработана усовершенствованная система (Egen et al.,
1979), в которой миниатюрная разделительная камера пространственно
отделена от резер-
Препаративное ИЭФ
131
вуара с образцом и системы охлаждения. Объем последней, таким образом,
может быть сколь угодно велик. Образец подается в короткую фокусирующую
камеру (расстояние между анодом и катодом всего 3 см), рабочее
пространство которой разделено на узкие отсеки с помощью системы
пластинчатых фильтров, расположенных параллельно электродам и параллельно
потоку жидкости. При ИЭФ в такой камере удается значительно снизить
неблагоприятное влияние ламинарного течения, электроэндосмоса и
конвекции. При циклическом методе разделения разделяемую смесь
многократно пропускают через фокусирующую камеру, а после выхода из
камеры каждый раз охлаждают, пропуская через расположенную отдельно
систему охлаждения. Это позволяет работать при достаточно высокой
загрузке образцом. Каждый отдельный цикл прохождения раствора через
камеру сопровождается только небольшим продвижением разделяемых
компонентов по направлению к области своих pi. Однако при многократном
повторении процесса в конце концов достигается стационарное состояние;
характерное для ИЭФ. Камера имеет 10 входных и 10 выходных каналов (по
числу отсеков). После выхода жидкости из камеры в каждом канале
регистрируется pH (с помощью 10 микроэлектродов) и УФ-поглощение (с
помощью десяти фотоэлементов). Работа системы контролируется и
управляется компьютером. Устройство всей системы и отдельно проточной
фокусирующей камеры показано на рис. 2,17, Л и Б. Манипулируя скоростью
потока в крайних каналах, компьютер может регулировать наклон градиента
pH, и в частности противодействовать катодному дрейфу, который
проявляется в неэлектрофоретическом смещении сфокусированных зон в
сторону катода. На сегодня данная модель представляет собой наиболее
изощренную систему препаративного изоэлектрического фракционирования. В
продаже имеется вариант такой системы производства американской фирмы
Ionics Inc., Watertown, Boston (Mass. USA).
2.1.16. Проточное ИЭФ в градиенте плотности
Другой подход . к крупномасштабному препаративному ИЭФ - это разделение в
непрерывном потоке градиента плотности. Впервые этот подход был
использован для препаративного электрофореза (Mel, 1960, 1964).
Предложенная автором система включала горизонтальный разделительный канал
длиной 30 см, высотой 3 см и шириной 0,7 см. Электродные отсеки,
расположенные сверху и снизу, были отделены от разделительного канала
диализными мембранами. Рабочие растворы электролита с различным
содержанием сахарозы подавались в канал через 12 входных трубок. После
прохождения по каналу в на-
9*
132
Глава 2
правлении, перпендикулярном направлению электрического поля, поток
жидкости, стабилизированный вертикальным градиентом плотности, вновь
делился на фракции системой выходных трубок.
Впоследствии в работах Fawcett, 1973 и 1976, были предложены две
модифицированные модели аппаратов этого типа - с большей и меньшей длиной
пути разделения. Первая из них состояла из двух охлаждающих пластин,
Образующих разделительную камеру высотой 25, длиной 23 и шириной 0,3 см.
Градиент плотности поступал в камеру с одной стороны через систему из 54
трубок, равномерно распределенных по высоте камеры. Горизонтальный поток
жидкости создавался 108-канальным перистальтическим насосом, который
контролировал скорость потока и на входе, и на выходе из камеры.
Устройство второй модели показано на рис. 2.18. Корпус (1) камеры (длина
20 см) сделан из оргстекла. Рабочее пространство камеры разделено на три
отсека перегородками (2) . Сужа-
Препаративное ИЭФ
183
123456789Ю
10
I I I I t I I I I I I I I 1 I I 1 i I I Л J
-17 -12
-14
-15
-16
11
Рис. 2.17. А. Схематическое изображение аппарата для циклического ИЭФ.
После выхода из блока охлаждения 10 фракций проходят через проточные
блоки измерения pH (10 электродов) и УФ-поглощения (10 микроячеек). За*
тем они с помощью многоканального насоса подаются в компактную
фокусирующую камеру (размер каждого отсека 20X2X0,2 см), а после этого -
снова в блок охлаждения. 1 - рН-метр, 2 - система контроля, 3 - УФ-
детектор, 4 - источник питания, 5 - блок охлаждения, б - управление УФ-
детектором, 7 - управление насосом, 8 - насос, 9 - фокусирующая ячейка.
[М. Bier, N. В. Egen, Т. Т. Algyer, G. Е. Twitty, R. A. Mosher; In:
Peptides: Structure and Biological Function (Gross I., Meienhofer J.,
eds.), Pierce Chemicals Co., Rockford II, 1979, pp. 79-89]. Б. Поперечное
сечение разделительной ячейки для циклического ИЭФ. 1-10 - разделительные
каналы, 11-выводы на многоканальный насос, 12 -прокладки из оргстекла
("спейсеры"), 13 - пластиковая панель (наружный каркас проточной камеры,
