Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 52

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 46 47 48 49 50 51 < 52 > 53 54 55 56 57 58 .. 171 >> Следующая

помощью капилляров, соединенных с перистальтическим насосом, со дна
ячейки собирают до 48 фракций. В качестве анолита и католита используют
5%-ную уксусную кислоту и 1,5%-ный этаноламин соответственно, которые в
про-, цессе ИЭФ постоянно прокачивают через электродные отсеки.
Температура в разделительной ячейке контролируется термистором.
Фракционирование обычно проводят при напряженности поля 110 В/см и
скорости потока жидкости 1 мл/мин.
Опубликованы обширные сведения об использовании этой системы для
разделения клеток и субклеточных органелл (Just et al., 1975 a, b; Just,
Werner, 1977 a, b, 1979). Например, удалось разделить смесь эритроцитов
человека, мыши и кролика в градиентах pH 3-10 и 5-7 при непрерывной
подаче смеси со скоростью 3 • 107 клеток/мин. Время прохождения клеток по
всему пути разделения составляло лишь 7 мин. Для предотвращения ¦слипания
клеток использовали 1 мМ ЭДТА. Сообщались также предварительные данные по
фракционированию легкой мито-
Препаративное ИЭФ
129
хондриальной фракции на лизосомы и собственно митохондрии. В этом случае
для предотвращения агрегации использовали различные полианионные
вещества, такие, как гепарин, хонд-роитинсульфат, поливинилсульфат,
декстрансульфат и полиане-толсульфоновую кислоту. Несмотря на
многочисленные данные этих авторов, а также данные Sherbert, 1978,
процесс ИЭФ клеток нельзя считать полностью отработанным (Righetti et
al., 1980 b). Так, сообщалось, что при ИЭФ амфолиты-носители могут
связываться с поверхностью клеток (McGuire et al., 1980). Есть сведения о
том, что в процессе ИЭФ лимфоциты из селезенки мыши утрачивают
жизнеспособность и подвергаются лизису (Castimpoolas, Griffith, 1980).
2.1.14. Высоковольтное ИЭФ в свободном потоке по Прусику
В работе Prusik, 1974, описан прибор для ИЭФ в непрерывном свободном
потоке, имеющий более традиционную конструкцию. Фактически он является
вариантом аппарата, предложенного в работе Hannig, 1961, модифицированным
для проведения ИЭФ (рис. 2.16). Раствор амфолитов-носителей прокачивают
через горизонтальную разделительную ячейку, в которой образуется слой
толщиной 0,5 мм, шириной 50 см, с эффективной длиной пути 44 см.
Охлаждение осуществляется потоком холодного воздуха, что дает возможность
рассеивать тепло, выделяющееся при мощности тока 0,36 Вт/см. На первом
этапе проводят предварительное фракционирование амфолитов-носителей.
Затем полученные фракции разливают в шесть резервуаров, расположенных на
вводе ячейки, и в один из них добавляют разделяемую смесь белков. При
использовании предварительно фракционированных амфолитов градиент pH
формируется значительно быстрее, что позволяет сократить время
фокусирования белков. Во избежание тепловой конвекции, которой
способствует неравномерное выделение джоулева тепла, ячейка должна быть
расположена горизонтально. Использование широкой ячейки (ширина 50 см)
обусловлено тем, что при достаточно большой длине пути разделения процесс
установления равновесия ИЭФ оказывается весьма продолжительным. Так, при
фракционировании панкреатической амилазы свиньи в градиенте pH 5-8 (0,3%
амфолины) время нахождения белка в ячейке составляло 150 мин при падении
напряжения 60 В/см.
В заключение отметим, что в продажу поступают аппараты для электрофореза
в свободном потоке различной конструкции: модель с широкой горизонтальной
ячейкой, а также модели как с широкой, так и с узкой вертикальными
ячейками. С небольшими модификациями все они, вероятно, могут быть
приспособ-
9-1488
130
Глава 2
Рис. 2,16. Схематическое изображение системы ИЭФ в свободном потоке с
предварительным фракционированием амфолитов-носителей. 1 - насос, по
дающий рабочий раствор в разделительную камеру, 2 - резервуары с
фракциями предварительно сфокусированных амфолинов, 2е - одна из фракций"
дополнительно содержащая образец (раствор белка), 3 - щелевая
разделительная камера, 4 - анодный отсек, 5 - катодный отсек, 6 и 7 -
вход и выход системы воздушного охлаждения, 8 - температурный детектор, 9
- пневмоусилитель, 10 - смеситель, 11-теплообменник, 12 - охлаждающее
устройство, 13 - вентилятор, 14 - стабилизатор уровня жидкости, 15 -
центробежный насос, 16 - резервуар с анолитом (кислотой), 17 - резервуар
с католитом (щелочью), 18 - коллектор фракций, 19 - коротковолновый
детектор, 20-воздушный клапан, 21-соединение с атмосферой, 22 - к насосу,
23, 24 - ионообменные мембраны. (Prusik, 1974.)
лены для проведения ИЭФ. Как правило, оказывается необходимым обеспечить
независимую циркуляцию католита и аноли-та, а в некоторых моделях -
снизить скорость протекания раствора через ячейку для достижения
равновесия ИЭФ.
2.1.15. Циклическое ИЭФ в непрерывном потоке
' Сущность этого нового подхода, названного циклическим ИЭФ ("recycling
IEF"), была описана в работах Egen et al., 1979; Bier, Egen, 1979, и Bier
et al., 1979. Известно, что для методов разделения в свободном потоке
(Fawcett, 1973), имеющих большое значение для крупномасштабного
Предыдущая << 1 .. 46 47 48 49 50 51 < 52 > 53 54 55 56 57 58 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed