Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 5

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 2 3 4 < 5 > 6 7 8 9 10 11 .. 171 >> Следующая

веществ. В случае окрашенных образцов картина разделения в левом колене
ячейки проецировалась на экран или небольшую стеклянную пластинку с
матовой поверхностью и фотографировалась. Регистрация неокрашенных
компонентов была основана на значительных изменениях коэффициента пре-
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ

ломления света в зонах "изоэлектрических линий". За задней' стенкой
ячейки, со стороны левого колена, помещали трафарет* в виде параллельных
тонких черных линий (решетка Ронши),. наклоненных под углом 4510 к
вертикальной оси электрофоретической колонки, и настраивали объектив для
получения контрастной проекции. При этом наблюдалось заметное искривление
линий за счет резкого изменения коэффициента преломления света на
границах каждой из зон разделяемых компонентов. Этот остроумный и весьма
эффективный способ регистрации сфокусированных зон недавно был "открыт"
заново (Edwards, Anderson, 1981).
Итак, снова возникает вопрос: если уже в 1954 году и теория, и
методология ИЭФ получили столь существенное развитие, то почему прошло
еще 12 лет, прежде чем метод ИЭФ занял достойное место среди других, уже
распространенных к тому времени методов фракционирования? Вероятно, дело
было-в том, что на этом этапе все еще недоставало одного важного
"связующего звена", которое, как мне кажется, появилось и. "замкнуло
цепь" только с окончательной разработкой концепции "амфолитов-носителей"
(Svensson, 1961). С позиции наших сегодняшних представлений сама идея,
лежащая в основе этой концепции, может показаться достаточно очевидной,
однако не следует забывать, что ее возникновению предшествовал не один
десяток лет неудач и разочарований. Градиенты pH, которые Колину
удавалось получать благодаря диффузии неамфотерных.
Рис. 1.2. Система для отбора фракций в U-образной ячейке Колина. А.
Устройство плунжера, используемого в качестве пипетки для отбора
материала зон, соответствующих линиям "изоэлектрического спектра". Б.
Способ введения плунжера. (Kolin, 1958.)
2-1488
18 Глава 1
- 1------------------------------------------------------
буферов с различными исходными значениями pH в электрическом поле, в
действительности были нестабильными (в работе Svensson, 1961, они
называются "искусственными" градиентами pH). Форма подобного градиента
постоянно изменяется из-за электромиградии и диффузии ионов с буферными
свойствами. Наиболее благоприятные условия фракционирования удавалось
получить, используя пару буферных растворов с одноименными ионами,
например два фосфатных буфера с разными исходными значениями- pH, между
которыми лежит область значений pi разделяемых компонентов. И все же в
градиентах этого типа можно было достичь лишь квазистационарного
распределения амфотерных макромолекул. В своей блестящей теоретической
работе Свенссон, опираясь на предложенное им понятие "амфо-лит-носитель",
сформулировал необходимые и достаточные условия образования равновесного
("естественного") градиента pH в электрическом поле (Svensson, 1961,
1962а,b). Буферные
ионы, формирующие такой градиент pH, должны удовлетворять двум основным
требованиям: 1) обладать амфотерными свойствами (для достижения
стационарного распределения по длине колонки) и 2) проявлять свойства
"носителей". Последнее требование не столь очевидное, но почти столь же
основополагающее. Для ИЭФ можно использовать не любые амфолиты, а только
"амфолиты-носители", т. е. амфотерные вещества, способные переносить ток
(хорошая проводимость), а также "привносить" и поддерживать pH (хорошая
буферная емкость). Именно благодаря появлению этой концепции и
последующему элегантному синтезу амфолитов-носителей (Vesterberg, 1969,
а) и сформировался метод ИЭФ в его современном виде.
1.2. Принципы ИЭФ
Принципиальные различия между ИЭФ и обычным электрофорезом
проиллюстрированы на рис. 1.3. При обычном электрофорезе разделяемая
смесь исходно вносится в виде узкой зоны, как правило со стороны катода.
Разделение происходит в процессе вынужденной электромиграции образца в
слое инертной матрицы (ацетилцеллюлоза, крахмал, агароза,
полиакриламидный гель, сефадекс и т. п.), насыщенной буфером с
определенным значением pH. В отсутствие заметных молекулярно-ситовых
явлений белковые зоны мигрируют с постоянной скоростью, поскольку в
данном буферном растворе они несут постоянный суммарный поверхностный
заряд. В рассматриваемом примере (рис. 1.3) это отвечает миграции двух
компонентов, А и Б, при постоянных значениях заряда, которые можно
определить по кривым титрования. При данном фиксированном значении pH=9
суммарный поверхностный заряд для белков А и Б со-
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
А+Б
А
Б
А
PH
А+Б
A -
Б
Ж-
шшшш
Щрн -
Суммарный заряд Градиент
8
О
А
Рис. 1.3. Сравнение зонального электрофореза (слева) и ИЭФ (справаК В
каждом случае проводится разделение смеси двух белков A (pi=5) ж Б
(р1=8), кривые титрования которых показаны справа. При обычном
электрофорезе в среде поддерживается постоянное значение pH=9, при
Предыдущая << 1 .. 2 3 4 < 5 > 6 7 8 9 10 11 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed