Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
Фракционирование обычно проводят при 4'°С, формируя градиент pH до
внесения образца. При начальных электрических параметрах 450 В и 1 мА
стабильный градиент pH устанавливается приблизительно за 24 ч. После
внесения образца фокусирование проводят еще в течение 72 ч. Устройство
камеры показано на рис. 2.8. Для получения отдельных фракций по окончании
ИЭФ лоток просто переводят в горизонтальное положение. При этом
размыкаются контакты между отдельными желобками, со дна которых собирают
фракции, содержащие сфокусированные компоненты. Значения pH в каждой
фракции можно определить непосредственно в приборе с помощью
комбинированного микроэлектрода. При ИЭФ этим способом меченых белков
вируса ящура в работе Talbot, Caie, 1975, выход компонентов составлял от
80 до 100%.
2.1.7. Зонально-конвекционное ИЭФ по Денкла
Интересный вариант аппарата Вальмета был разработан и запатентован Денкла
(Denckla, 1975, 1976). Конструкция разделительной камеры, показана на
рис. 2.9. Она разделена на ряд
Препаративное ИЭФ
119
отсеков невысокими перегородками (помечены цифрой 9), приклеенными к дну
камеры. Более высокие перегородки (10), приклеенные к боковым стенкам
камеры и примерно на 1 мм не достающие до дна, разделяют каждый отсек на
два колена. Таким образом, система представляет собой цепочку
последовательно соединенных U-образных ячеек. Все перегородки - полые, в
их внутреннем пространстве циркулирует охлаждающая жидкость. Помимо
высокоэффективной системы охлаждения важным преимуществом данной
конструкции является также действенная система защиты от электроэндосмоса
(перемещению водяного слоя Гельмгольца препятствуют очень узкие зазоры
между перегородками 10 и дном камеры). По сравнению с аппаратом Вальмета
для этого прибора допустимое падение напряжения на единицу длины
оказывается выше в 10 раз, разрешающая способность - в 3 раза,
эффективность теплоотвода на единицу объема - в 6 раз, скорость
разделения - в 8 раз и максимальная загрузка препаратом - в 500 раз.
Фракционирование можно проводить при напряжении до 60 000 В и мощ-Э 14
Рис. 2.9. Схематическое изображение аппарата Денкла для зоиально-конвек-
ционного ИЭФ. 1 - прямоугольная камера, заполненная рабочим раствором, 2
- дно камеры, 3, 4 - две противоположные торцевые стенки, 7, 8 -
платиновые электроды, 9 -нижние перегородки, укрепленные на дне камеры,
10 - верхние перегородки, укрепленные на боковых стенках и не доходящие
до дна камеры (все перегородки типа 9 и 10 - полые, что обеспечивает
циркуляцию охлаждающей жидкости в их внутреннем пространстве), 11 -
дополнительные каналы системы охлаждения, 12 -обычный уровень рабочего
раствора амфолитов, 13, 14 -корпус и крышка из изолирующего материала. х,
у, г -ширина, высота и глубина колена U-образной ячейки. (Denckla, 1975,
1976.)
120
Глава 2
ности 6000 Вт (3 Вт/мл раствора). В методе Денкла применяется также
принцип "каскадного разделения", суть которого заключается в
последовательном использовании трех аналогичных по конструкции, но
различающихся по размеру камер для фракционирования белков в поэтапно
сужающемся градиенте pH. Все три камеры содержат по 10 ячеек, а общий
объем каждой последующей камеры примерно в 10 раз меньше объема
предыдущей.' Таким образом, после фракционирования в камере большегб
размера содержимое одной из ее ячеек можно полностью перенести в
следующую камеру. При этом все ячейки малой камеры оказываются
заполненными, и фракционирование может быть продолжено в более пологом
градиенте pH практически без разбавления и дополнительного расхода
амфолитов-носителей. Разрешение, получаемое с помощью этого метода, -
около 0,01 ед. pH. Для достижения такой разрешающей способности число U-
образных ячеек в аппарате Вальмета пришлось бы увеличить до 700. Автор
использовал свой прибор для очистки гормонов из экстрактов гипофиза
(Denckla, 1974, 1977).
2.1.8. Зонально-конвекционное ИЭФ в сплошной спирали
Приспособление другого типа, также основанное на принципе Вальмета, было
предложено в работе Macko, Stegeman, 1970. ИЭФ проводится в свернутой в
спираль полиэтиленовой трубке длиной 10 см, с внутренним диаметром 4 мм и
толщиной стенок 1 мм. С помощью двухсторонней липкой ленты спираль
зафиксирована на медной трубке диаметром 20 мм. Фракционирование в такой
спирали происходит по принципу зональноконвекционного ИЭФ, при этом
каждый виток спирали представляет собой как бы одну ячейку аппарата
Вальмета. Спираль заполняют 10 мл раствора, содержащего сахарозу в
концентрации 10% и амфолины в концентрации 1%. Полная загрузка препаратом
- около 10-15 мг. Концы спирали, расположенные вертикально, заполняют
анолитом и католитом. При ИЭФ спираль погружают в ледяную баню с
перемешиванием или в термостат на 2РС таким образом, что концы спирали
остаются выше уровня охлаждающей жидкости. По окончании разделения
спираль быстро замораживают, предпочтительно жидким азотом, а затем
разрезают на сегменты, содержимое которых переносят в маленькие пробирки.
