Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 44

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 38 39 40 41 42 43 < 44 > 45 46 47 48 49 50 .. 171 >> Следующая

переходе жидкости из колонки в сливную трубку также отрицательно
сказываются на результатах фракционирования. Дополнительное размывание
зон может происходить и за счет краевых эффектов при течении жидкости по
капилляру, соединяющему колонку с коллектором фракций. Поэтому длина
такого капилляра должна быть минимальной. Следует также использовать
проточные кюветы минимального объема. Прохождение элюата через
перистальтический насос является еще одним фактором, способствующим
размыванию зон. Его можно устранить, проводя элюцию без насоса или
подключая насос к верхней части колонки (через трубку 5 на рис. 2.2) и
подавая через него воду таким образом, чтобы она постепенно вытесняла
вниз содержимое колонки. Скорость элюции в этом случае будет определяться
скоростью подачи воды перистальтическим насосом.
В работе Boddin et al., 1975, предложен метод, который позволяет
проводить элюцию из фокусировочной колонки под напряжением. Авторы
использовали конструкцию обычного аппарата для электрофореза и
полиакриламидном геле. Нижнее отверстие колонки (трубки) закрывали
пробкой с отверстием, а нижний электрод отделяли от сахарозного градиента
ионопроницаемой мембраной, обеспечивающей непрерывный электрический
контакт.
Препаративное ИЭФ
109
2.1.2. Колонки фирмы ISCO
Фирма ISCO (Instrumentation Speciality Company - специализированное
объединение по производству оборудования) производит два типа
фокусировочных колонок: модель 210 - для аналитического и
полупрепаративного ИЭФ и модель 630 - для препаративного ИЭФ. Первая
имеет внутренний диаметр 1 см и длину 30 см; ее устройство показано на
рис. 2.4. Максимальный объем градиента - 23 мл, максимальная загрузка по
белку - около 10 мг. При температуре охлаждающей жидкости 2'°С можно
проводить ИЭФ при электрической мощности до 15 Вт. Препаративная модель
имеет аналогичное устройство. С ее помощью можно проводить ИЭФ в
градиенте объемом до 160 мл при длине пути до 32 см. Термостатирование
препаративной колонки при 2СС позволяет прикладывать электрическую
мощность около 20 Вт. Интересной особенностью обеих моделей является
коаксиальное расположение электродных камер относительно разделительной
колонки. Каждый электрод отделен от рабочего объема концентрической
мембраной, которая препятствует проникновению в колонку продуктов
электролиза, способных исказить градиент pH. Эти мембраны предотвращают
также выход компонентов градиента за пределы разделительной колонки.
Преимуществом колонок этого типа является наличие сканирующего
устройства, которое позволяет непосредственно контролировать процесс ИЭФ.
Для этого отключают ток и постепенно вытесняют столб градиента вверх так,
чтобы весь его объем проходил мимо окошка денситометра, который
регистрирует профиль поглощения при одной или нескольких длинах волн.
Таким образом, проводя повторные сканирования через определенные
промежутки времени, можно следить за ходом разделения и точно определить
момент установления равновесия в системе. Кроме того, имеется специальное
приспособление для внесения препарата в середину колонки на любой стадии
процесса. Таким образом можно провести сканирование градиента до внесения
образца для записи базовой линии поглощения предварительно
сфокусированных амфолинов (Righetti, Drysda-le, 1971). При сканировании
градиент продвигают вверх по колонке мимо измерительного фотоэлемента,
накачивая тяжелый раствор сахарозы в нижнюю часть колонки. Сканирование и
опорожнение колонки осуществляется при помощи непульсирующего насоса
шприцевого типа. В этой конструкции в отличие от колонок фирмы LKB
практически не происходит перемешивания жидкости на выходе из колонки,
поэтому удается получать достаточно узкие зоны разделяемых компонентов.
Таким образом, появляется возможность отчасти избежать искажений, связан-
110
Глава 2
Рис. 2.4. Схематическое изображение колонки фирмы ISCO (модель 210) для
электрофоретического фракционирования в градиенте плотности. 1-платиновый
проволочный электрод, 2 - полупроницаемые мембраны, 3 - рубашка
охлаждения, 4 - фильтр и измерительный фотоэлемент, 5 - вакуумная ртутная
лампа, 6 - фильтр и фотоэлемент сравнения, 7 - кварцевые окошки, 8 -
подвижная заслонка, 9 - насос шприцевого типа, 10 - прозрачная
центральная трубка, И-сантиметровая шкала, 12 - центральная тефлоновая
трубка (внутренний диаметр 1 см), 13 - основание колонки, 14 - съемная
головка для заполнения колонки градиентом плотности и для внесения
образца, 15 - вывод на коллектор фракций, 16 - ввод охлаждающей жидкости,
17 - вывод охлаждающей жидкости, 18 - соединительный канал проточной
системы охлаждения, 19 - нижний электродный отсек, 20 - верхний
электродный отсек, 21-разделительная колонка, 22 - источник питания со
стабилизацией по мощности, 23 - система УФ-стандартов. (Leaback, Wrigley,
1976.)
Препаративное ИЭФ
111
ных с конвекцией и с различными эффектами турбулентного и ламинарного
течения элюата, которые характерны для других систем. Принципиальное
Предыдущая << 1 .. 38 39 40 41 42 43 < 44 > 45 46 47 48 49 50 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed