Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
располагается между поверхностями двух концентрических полых цилиндров,
что позволяет использовать водяное охлаждение и с внешней, и с
106
Глава 2
внутренней сторон. При охлаждении циркулирующей жидкостью с температурой
2-4РС можно проводить ИЭФ при мощности 3-4 Вт для малой колонки (110 мл)
и 8-10 Вт -• для большой (440 мл).
Применение новых источников питания со стабилизацией по мощности
позволило повысить предельную мощность до 15 Вт (Vmax= 1600 В) ДЛЯ МЭЛОЙ
КОЛОНКИ И ДО 30 Вт (Vmax = 2000 В) - для большой (Winter, Karlsson,
1976). В работе Haglund, 197J, отмечается; что фокусировочную колонку не
следует охлаждать ниже 2-4 °С. Температурный коэффициент для вязкости и
электропроводности в смеси сахароза-амфолины имеет практически неизменную
величину вплоть до 1ЮС, но резко возрастает при более низких
температурах. Соответственно незначительные колебания температуры в
колонке, термостатируемой ниже чем при 2ЮС, могут вызвать искажение зон и
ухудшить разрешение.
Сила тока при ИЭФ максимальна в самом начале эксперимента, когда все
амфолиты хаотически распределены по колонке. Для предотвращения
чрезмерного разогрева следует строго контролировать начальное напряжение
в системе. В обычных условиях, при концентрации амфолинов около 1%,
начальное напряжение может составлять 400-500 В. В дальнейшем, после
падения электропроводности в результате миграции амфолитов в зоны своих
изоточек, для повышения разрешающей способности напряжение можно поднять
до 1600-2000 В. Источники питания со стабилизацией по мощности проводят
эту операцию автоматически. После того как сила тока установилась на
неизменно низком уровне, можно считать, что система достигла состояния
равновесия. Время, за которое устанавливается равновесие, зависит от
конкретных электрофоретических условий, от температуры охлаждающей
жидкости и при работе с традиционными источниками питания обычно
составляет от 24 до 72 часов для обоих типов колонок. Это время удается
сократить, используя системы стабилизации мощности тока.
ИЭФ в узком диапазоне pH или при концентрации амфолитов выше 1% протекает
значительно дольше. Определить оптимальное время фокусирования в каждом
конкретном случае можно только эмпирически. Следует подчеркнуть, что на
завершающем этапе миграция амфолитов и белков к своим равновесным
положениям происходит настолько медленно, что падение силы тока может на
этом этапе оказаться практически незаметным. Соответственно лучше
перестраховаться и продолжить разделение еще в течение нескольких часов
после того, как сила тока уже вышла на плато.
По окончании ИЭФ содержимое колонки сливают через отверстие в ее нижней
части (рис. 2.3) или вытесняют через верх более плотным раствором,
подаваемым снизу. Собирают фрак-
*280
300 400
Объем, мл
10 20 30 40 50 60 70
Номер фракции V
Рис. 2.3. Опорожнение колонки (фирмы LKB) после ИЭФ. А. По окончании
разделения закрывают заглушку (2) центрального электродного отсека и
откачивают легкий электродный раствор через выходное отверстие отростка
(1). Б. К отростку присоединяют трубочку, идущую через перистальтический
насос к сосуду с дистиллированной водой. Верхнюю часть колонки заполняют
водой, а затем герметизируют место стыка трубочки с входным отверстием
отростка. Элюат желательно пропускать через проточную кювету УФ-детектора
с самописцем. Данный способ элюции (вытеснение водой сверху) более
совершенен, чем другие варианты опорожнения колонки - "самотеком" (т. е.
без насоса) или через насос, подсоединенный к выходу из колонки. В.
Примеры типичных профилей УФ-поглощения и градиентов pH, регистрируемых
при элюции с вытеснением. Правый график иллюстрирует, каким образом
определяют значение pi для данного белкового пика. (С любезного
разрешения фирмы LKB Produkter АВ.)
108
Глава 2
ции по 1-4 мл и определяют в них pH и содержание белка. Это можно делать
вручную или автоматически, пропуская элюат через проточную кювету
прибора, измеряющего и записывающего pH и УФ-поглощение. Желательно
измерять pH во фракциях при той же температуре, при которой проводилось
ИЭФ (разд. 4.5). Найдено, что оптимальная скорость элюции составляет 60
мл/ч для колонки объемом 110 мл и 240 мл/ч для колонки объемом 440 мл.
Использование колонок этого типа оказалось весьма эффективным для решения
целого ряда задач. Тем не менее они не лишены некоторых конструктивных
недостатков, накладывающих ограничение на величину предельной загрузки
образца, а также приводящих к ухудшению реального разрешения компонентов
из-за размывания зон при элюции. Многие белки весьма склонны к
преципитации при pH вблизи их pi. Осаждение другого рода может
происходить тогда, когда плотность в сфокусированной зоне, содержащей
большое количество белка, окажется выше плотности раствора на данном
участке градиента. Диффузия сфокусированных компонентов, происходящая в
ходе достаточно продолжительного процесса элюции в отсутствие
электрического поля, и частичное перемешивание зон в нижней камере при
