Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
раствор может содержать аспарагиновую, глутаминовую, уксусную или
лимонную кислоты, а катодный раствор - аргинин, лизин, трис или гистидин.
При выбо_ре полярности электродов следует учитывать, что анод лучше,
располагать в нижней части колонки, чтобы свести к минимуму искажения,
которые могут возникнуть в результате ионизации сахарозы в щелочной среде
у катода (Flatmark, Vesterberg, 1966). Следует учитывать и диапазон
значений pi разделяемых компонентов. Целесообразно выбирать полярность
электродов таким образом, чтобы белки фокусировались в нижней половине,
ближе к выходу из колонки. Это уменьшит размывание сфокусированных зон в
процессе элюции, которую проводят в отсутствие электрического поля. Кроме
того, при выборе полярности электродов надо учитывать распределение
электропроводности в градиенте pH. Известно, что в полностью
сформированном градиенте имеется минимум электропроводности между pH 6 и
7 (разд. 1.5.5). С другой стороны, на распределение электропроводности
влияет вязкость раствора, которая изменяется вдоль всего градиента
плотности. Возрастание плотности и вязкости раствора вызывает понижение
электропроводности. Обычно стараются выбрать полярность электродов так,
чтобы оба фактора (pH и вязкость) частично компенсировали друг друга, т.
е. чтобы минимум электропроводности (в области pH 6-7) располагался в
верхней части колонки. Следовательно, при ИЭФ в диапазоне pH ниже 6 в
качестве верхнего электрода следует выбирать катод, а при ИЭФ в диапазоне
pH выше 6 - анод. В частности, при использовании амфолинов pH 9-11 вверху
обязательно должен располагаться анод. Аналогично при работе с амфолинами
pH 2,5-4 верхний электрод должен быть катодом. Однако если при
препаративном ИЭФ, особенно в случае сильно загрязненных препаратов,
выпадает осадок, то полярность электродов лучше выбрать так, чтобы
преципитация происходила в нижней части колонки. Следует иметь в виду,
что при обычной элюции капилляр может забиться осадком, и в этом случае
лучше проводить ступенчатую элю-цию через верх колонки (разд. 4.1).
Внесение образца. Для ИЭФ, которое является равновесным методом, способ
внесения образца не так важен, как для других электрофоретических
методов, где необходимо наносить препарат в виде очень тонкого слоя. При
ИЭФ образец вместе с амфолитами и сахарозой можно включить в состав
тяжелого или легкого градиентных растворов или в оба раствора одновре-
Препаративное ИЭФ
105
менно. В ходе ИЭФ образец концентрируется, поэтому его начальный объем не
имеет значения, он может составлять до 80% полного объема колонки. Можно
вносить образец и в виде более узкой зоны ближе к предполагаемой области
его фокусирования. Это уменьшает время проведения эксперимента и
предотвращает неблагоприятное влияние кислой и щелочной среды на
разделяемые белки, так как позволяет избежать их контакта с крайними
областями градиента pH.
Как отмечалось в предыдущей главе, величина предельно допустимой загрузки
препаратом зависит от многих факторов. Среди них - геометрия колонки,
количественный и качественный состав препарата, растворимость разделяемых
компонентов в изоточке, диапазон pH разделения, концентрация амфолитов-
носителей и напряженность электрического поля. Увеличение площади
поперечного сечения (так же как и сужение рабочего диапазона pH)
позволяет повысить загрузку препаратом, поэтому при работе с большей из
двух колонок фирмы LKB, имеющей такую же высоту, что и меньшая колонка,
четырехкратное различие в объеме позволяет пропорционально увеличить
содержание белка в образце. Количество соли и буферных компонентов,
попадающих в систему вместе с препаратом, не должно превышать 0,5 мМ в
расчете на колонку объемом 110 мл и
1,5 мМ - в расчете на колонку 440 мл. Высокая концентрация соли может
привести к недопустимо высокой плотности тока в начале эксперимента, а
также к дополнительному образованию кислоты у анода и щелочи у. катода.
Рекомендуется предварительно отдиализовать образец против 1 % -ного
глицина (Vester-berg et al., 1967; Wadstrom, 1967) или 1%-ного раствора
амфо-линов соответствующего диапазона pH. Глицин, как известно, является
"плохим амфолитом-носителем". В диапазоне pH 4-8 он практически не
заряжен, но существенно увеличивает диэлектрическую проницаемость среды
и, таким образом, стабилизирует растворенные белки. Перед использованием
диализный мешочек следует обработать горячей 10%-ной уксусной кислотой,
тщательно промыть дистиллированной водой, а затем вымочить в
соответствующем растворе, приготовленном для диализа. Поскольку белки,
как правило, более устойчивы в слабощелочной среде, для диализа часто
используют амфолины диапазонов pH 6-8, 7-9 и 8-10.
Электрические параметры. Общая электрическая мощность, приложенная к
системе, не должна превышать возможности колонки по рассеянию
выделяющегося тепла. Фокусировочные колонки фирмы LKB оснащены весьма
эффективной системой теплоотдачи. Рабочее пространство колонки
