Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
градиенте. Это связано со смещением асимметричного потенциала стеклянного
электрода в D20 (по отношению к потенциалу в Н20). Пока что не ясно,
найдут ли градиенты D20 практическое применение в области препаративного
колоночного ИЭФ.
Рис. 2.2. Подготовка к работе колонки фирмы LKB для препаративного ИЭФ.
А. Тяжелый электродный раствор (ТЭР) заливают в нижнюю часть колонки при
открытом клапане (3) центрального электродного отсека (2). Этот раствор
заливают через газоотводную трубку (4), с тем чтобы избежать загрязнения
стенок разделительной камеры (1). Б. Градиент плотности наслаивают через
входное отверстие отростка для внесения препарата (5) с помощью
перистальтического иасоса. Для формирования градиента плотности удобно
использовать изображенный на рисунке смеситель. В стаканы смесителя
заливают легкий градиентный раствор (Л ГР) и тяжелый градиентный раствор
(ТГР). В. Легкий электродный раствор (ЛЭР) наслаивают поверх градиента до
полного погружения электродной петли (6). После этого электроды
присоединяют к блоку питания. (С любезного разрешения фирмы LKB Produkter
АВ.)
102
Глава 2
Таблица 2.1. Исходные растворы для приготовления градиента плотности в
расчете на колонки (LKB) объемом 110 и 440 мл с использованием трех
различных вариантов стабилизации (сахароза, глицерин, этиленгликоль)
Растворы для смесителя градиента Колонка 110 мл (LKB 8100-1) Колонка 440
мл (LKB 8100-2)
Стабилизация сахарозой '
Тяжелый градиентный раствор
Сахароза 27 Г 107,5 г
Н20 + амфолины 37 мл 150 мл
(+образец)
Общий объем 54 мл 215 мл
Концентрация сахарозы 50% 50%
Легкий градиентный раствор
Сахароза 2,7 г 10,75 г
Н20+амфолины 53 мл 207 мл
(+образец)
Общий объем 54 мл 215 мл
Концентрация сахарозы 5% 5%
Стабилизация глицерином
Тяжелый градиентный раствор 30 мл 118 мл
Глицерин, 87% 24 мл 97 мл
Н20+амфолины (+ образец)
Общий объем 54 мл 215 мл
Концентрация глицерина 60% 60%
Легкий градиентный раствор Н204-амфолины (+образец) =
= общий объем 54 мл 215 мл
Концентрация глицерина 0% 0%
Стабилизация этиленгликолем Тяжелый градиентный раствор
Этиленгликоль, 100% 40,5 мл 161 мл
Н20 + амфолины 13,5 мл 54 мл
(+ образец)
Общий объем 54 мл 215 мл
Концентрация этиленгликоля 75 Го 75%
Легкий градиентный раствор Н20 + амфолины (-f образец) =
= общий объем 54 мл 215 мл
Концентрация этиленгликоля 0 % 0%
Итак, при заполнении колонки градиент плотности, содержащий амфолиты и
образец, наслаивают на плотную "подушку" раствора электролита,
расположенную в нижней части колонки. Поверх градиента наслаивают легкий
раствор второго электролита (рис. 2.2). В табл. 2.1 приведены прописи
исходных растворов для получения градиентов плотности с использованием
трех вариантов стабилизации (сахароза, глицерин и этиленгли-
Препаративное ИЭФ
103
Таблица 2.2. Электродные растворы для двух вариантов выбора полярности
электродов в расчете на колонки (фирмы LKB) объемом ПО и 440 мл
Электродный раствор Колонка ПО мл (LKB 8100-1) Колонка 440 мл (LKB
8100-2)
Анод вверху колонки
Катодный раствор (pH-11,7) Общий объем Концентрация сахарозы Анодный
раствор 15 г сахарозы +10 мл Н20 + 6 мл 1 М NaOH 25 мл 60% 1,5 мл 1 М
Н3Р04 4-8,5 мл Н20 48 г сахарозы 4*30 мл Н20 4-20 мл 1 М NaOH 80 мл
60% 6 мл I М Н3РО4 Н-34 мл Н20
Общий объем 10,0 мл 40,0 мл
Катод вверху колонки
Катодный раствор 2,5 мл 1 М NaOH Н-7,5 мл Н20 10 мл 1 М NaOH + 30 мл Н20
Общин объем Анодный раствор (pH-1,2) -* 10,0 мл 15 г сахарозы 4-12 мл Н20
-44 мл 1 М Н3РО4 40 мл 48 г сахарозы + 38 мл Н20 + 12 мл 1 М Н3РО4
Общий объем Концентрация сахарозы 25 мл 60% 80 мл 60%
коль) в расчете на колонки объемом 110 и 440 мл. В табл. 2.2 предложен
состав электродных растворов для обоих типов колонок и для обоих
вариантов выбора полярности верхнего электрода (который может служить и
катодом, и анодом).
Электродные растворы. Выбор полярности электродов. Для защиты амфолитов-
носителей от анодного окисления и катодного восстановления их отделяют от
электродов растворами кислоты или щелочи соответственно. В ходе ИЭФ
кислоты и основания удерживаются у соответствующих электродов и амфолиты
обоих крайних областей pH "отталкиваются" от электродных камер,
расположенных в противоположных концах колонки. Как правило, в качестве
анолита используют разбавленный раствор сильной кислоты (например, 1%-ную
фосфорную пли серную кислоту), а в качестве католита - разбавленный
раствор основания (2%-ный этаноламин, 2%-ный этилендиамин или 8%-ный
NaOH). При ИЭФ в узком диапазоне pH (например, шириной в 1 ед. pH) в
качестве электролитов рекомендуется использовать более слабые кислоты и
основания. Желательно, чтобы значения pH в растворах электролитов не
слишком силь-
104
Глава 2
но выходили за' рамки рабочего интервала pH разделения для предотвращения
чрезмерного скачка pH и электропроводности на границе между электродными
камерами и рабочим пространством разделительной колонки. Так, анодный
