Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
буферных групп. Во-вторых, при соответствующем подборе исходных реагентов
- слабой кислоты и слабого основания - мы сможем иммобилизовать любой
градиент протяженностью в 1-2 ед. pH, руководствуясь непосредственно
требованием оптимального разделения данной белковой смеси. И, в-третьих,
поскольку буферные компоненты иммобилизованы на матрице геля (которой
может служить как полиакриламид, так и сефадекс или агароза), становится
возможной изоионная элюция сфокусированных белков, свободных от примеси
высокомолекулярных или низкомолекулярных амфолитов.
Может показаться, что все это звучит слишком красиво, чтобы быть правдой,
и тем не менее я готов держать пари, что метод вскоре заработает. А если
нет, то пусть эту книгу постигнет самая жестокая участь в духе Брэдбери -
"451 по Фаренгейту". (Bradbury, 1953)!
ГЛАВА 2
Препаративное изоэлектрофокусирование
За прошедшие годы стало ясно, что ИЭФ действительно является весьма
эффективным методом препаративного фракционирования. Любой хороший
препаративный метод должен обладать высокой разрешающей способностью и
давать высокий выход при разделении значительных количеств материала без
существенного изменения физико-химических или биологических свойств
разделяемых объектов. ИЭФ удовлетворяет большинству этих критериев и
имеет также дополнительные преимущества. Например, в отличие от многих
других методов ИЭФ позволяет добиться уникального сочетания высокой
загрузки образца и хорошего разрешения. В предыдущей главе уже
отмечалось, что оба этих параметра удается оптимизировать при
фокусировании в пологом градиенте pH, которое сопровождается образованием
более широких зон, способных "вместить" большее количество препарата, чем
соответствующие участки крутого градиента pH (разд. 1.5.9). Другое
преимущество ИЭФ заключается в том, что при надлежащем выборе интервала
pH многие ненужные компоненты окажутся вовсе удалены из зоны
фракционирования. Наконец, поскольку ИЭФ - это равновесный метод,
разделение сопровождается концентрированием разбавленных образцов.
С помощью различных экспериментальных приемов, использованных для
выявления реальных возможностей ИЭФ, удалось подтвердить предсказанные
теорией значения предельной загрузки и разрешающей способности метода при
хороших выходах как по белку, так и по биологической активности. Среди
удачных экспериментальных подходов к препаративному фракционированию
можно отметить ИЭФ в вертикальных колонках со стабилизацией при помощи
градиента плотности, в горизонтальных лотках со спонтанно образующимся
градиентом плотности, в зонально-конвекционных системах, а также в
сплошных полимерных гелях типа ПААГ или в гранулированных гелях типа
сефадекса - в форме горизонтального слоя или в вертикальной колонке.
Каждая система имеет свои преимущества. Некоторые из этих систем,
например, выигрывают за счет
7-1488
98
Глава 2
изоэлектрической преципитации, которая сама по себе является бичом многих
других систем.
В этой главе рассмотрено большинство используемых в настоящее время
вариантов препаративного ИЭФ. Особое внимание уделено таким параметрам,
как максимальная загрузка, разрешающая способность, возможность
детектирования и выход разделяемых компонентов. Обсуждаемые препаративные
системы, позволяющие фракционировать от миллиграммов до граммов белка,
разбиты на три основные группы: ИЭФ в жидкой среде, ИЭФ в слое сефадекса,
ИЭФ в полиакриламидном геле.
В качестве обзоров общего характера по препаративному ИЭФ можно
порекомендовать следующие публикации: Rilbe, 1970; Winters, Karlsson,
1976; Fawcett, 1975 b, 1976 a; Bours, 1976; Righetti, 1975 a; Radola,
1976; Quast, 1979; Just, Werner, 1979.
2.1. Препаративное ИЭФ в жидкой среде
2.1.1. Колонки фирмы LKB
Один из самых первых вариантов препаративного ИЭФ был основан на
применении колонок, в которых антиконвекционная стабилизация градиента pH
достигается с помощью вертикального сахарозного градиента плотности.
Конструкция колонки, предложенная в работе Svensson, 1962 b, была взята
на вооружение фирмой LKB, которая выпускает два вида колонок - объемом
110 (LKB 8100-1) и 440 мл (LKB 8100-2). Устройство колонки показано на
рис. 2.1. Допустимое содержание белка в зоне при ИЭФ составляет 5-25 мг
для малой колонки и 20- 80 мг для большой. Максимальная загрузка колонки
препаратом зависит от числа компонентов, их растворимости в изоточке и
формы градиента pH. Для большинства белков загрузка не. должна превышать
5 мг на 1 см2 площади поперечного сечения колонки.
Колонки этого типа требуют значительного расхода амфолитов-носителей.
Концентрация амфолинов, как правило, должна быть не ниже 1%, что
соответствует 1,1 и 4,4 г сухого вещества для малой и большой колонок
соответственно. В случае амфолинов крайних диапазонов pH 2,5-4 и 9-11
рекомендуемая рабочая концентрация составляет 0,5%, поскольку они
обладают вдвое большей электропроводностью, чем амфолины других
диапазонов pH.
