Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
ионных форм обоих амфолитов смеси; б) профили pH, электропроводности и
электрического потенциала, а также некоторые другие дополнительные
сведения.
В табл. 1.8 перечислены бинарные системы, которые позволяют проводить ИЭФ
в диапазоне pH шириной в 1-2 ед. pH (Bier et al., 1981). На рис. 1.22
воспроизведены концентрационный и pH-профили, рассчитанные на ЭВМ для
одной из систем- аспарагиновая кислота/ж-а минобензойная кислота. Видно,
что в этой системе формируются практически симметричный концен-
Рис. 1.22. Рассчитанные с помощью ЭВМ концентрационные и рН-профили
формирующиеся при фокусировании аспарагиновой кислоты (Asp; pl=2,95
ДрЯ=1,91) и ж-аминобензойной кислоты (мАБК; р! = 3,93, Др/С=1,62) при
плотности тока 0,40 мА/см2. Расчетное падение напряжения в колонке
составляет 0,59 В. (Bier et al., 1981.)
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
9S
трационный профиль и почти линейный градиент pH. Как ни странно, пара
(His-His)/His, которая, казалось бы, может служить идеальной комбинацией,
на самом деле не позволяет получить градиент pH, пригодный для ИЭФ.
Наиболее важный вывод, который может быть сделан на основании подобных
расчетов, заключается в том, что при ИЭФ в простых смесях амфо-литов
(вероятно, так же, как и в случае БЭФ) хороший градиент pH удается
получить только при очень низком напряжении. Это означает, что
фокусирование должно проводиться весьма продолжительное время. Так,
фокусирование гемоглобина в системе (Gly-Gly-Gly)/His проводили в течение
6 сут при напряжении 0,5 В/см (ср. с напряжением 400 В/см в работе Radola
et al.* 1981). Уже при напряжении 2 В/см или выше фракционирование
заметно ухудшается, так как распределение амфолитов перестает быть
симметричным, зоны амфолитов значительно меньше перекрываются, образуется
широкая область почти нулевой электропроводности, препятствующая миграции
белков за ее пределы.
Данное исследование имеет фундаментальное значение для понимания сущности
процессов фокусирования. Авторы отмечают, однако, что исследованные ими
системы (как и системы БЭФ) определенно малопригодны для аналитического и
даже для препаративного изоэлектрического фракционирования.
1.11.7. Иммобилизованные градиенты pH
Хотя в настоящее время данные о химически иммобилизованных градиентах pH
в литературе отсутствуют, я не сомневаюсь, что именно этот подход
ознаменует новый этап естественного развития метода. Исследования,
проводимые в последние годы в нашей группе, были направлены на решение
этой проблемы, главным образом в ее препаративном аспекте (Righetti,
Giartazza, неопубликованные результаты). С другой стороны, недавно мне
стало известно, что аналогичная методика уже запатентована (Rosengren et
al., 1978, 1981).
Проследив ход развития теории ИЭФ от "искусственных" градиентов Колина
через амфолиты-носители Свенссона вплоть до модельных бинарных систем
Бьера, я понял, что иммобилизованные градиенты pH можно получать
достаточно просто. Расчеты, выполненные в работе Bier et al., 1981,
показали, что проведение ИЭФ в системе из двух амфолитов в принципе
возможно, но нецелесообразно, поскольку даже 'при минимальном напряжении
оба амфолита постепенно смещаются к соответствующим электродам, образуя
обширную область низкой электропроводности и слишком крутой градиент pH.
Это препятствует нормальному изоэлектрическому фракционированию белков.
96
Глава 1
Проблема может быть решена с помощью ИЭФ в химически иммобилизованном
градиенте pH. Разработка и внедрение этого оригинального
экспериментального подхода, судя по всему, окажется завершающим этапом,
высшим достижением эволюции метода.
Возьмем обычный прибор для создания градиента. В смеситель нальем
раствор, содержащий мономеры для получения полиакриламидного геля (Г=5%,
С=5%), а также сахарозу (30°/о), акриловую 'кислоту (10 мМ, рК 4,5) и
винилимидазол (5 мМ, рл 6,5), в резервуар - такой же раствор акриламида,
но содержащий сахарозу в концентрации 5%, 5мМ акриловую кислоту и 10 мМ
винилимидазол. После заполнения формы смесью с линейным градиентом
плотности и полимеризации мы получим гель, несущий химически
иммобилизованный на матрице линейный градиент концентрации акриловой
кислоты 10-5 мМ (от анода к катоду) и встречный линейный градиент
концентрации винилимидазол а 10-5 мМ (от катода к аноду). Эти встречные
градиенты прямо задают линейный градиент pH 4,5-6,5 с минимумом
электропроводности и буферной емкости посередине, в диапазоне значений
pH, равноудаленных от обоих значений рК. Тем не менее в этой системе
именно благодаря химической иммобилизации буферных компонентов
оказывается возможным равновесное фокусирование разделяемых белков при
очень высоком напряжении, характерном для обычного ИЭФ в системах
амфолитов-носителей. Применение этого подхода может ознаменовать новую
революцию в области изоэлектрического фракционирования. Во-первых,
появится уникальная возможность проводить разделение в строго
определенных условиях среды, при заданной ионной силе и концентрации
