Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
сформировать эффективный градиент pH. Так, для фосфатного буфера дрН/дТ =
-0,003. Это означает, что при температурном градиенте от 0 до 100|ОС (что
достаточно для денатурации многих, если не всех, белков) градиент pH в
разделительной колонке будет составлять только 0,3 ед. pH. Один из
немногих пригодных буферов - это трис, для которого дрН/дТ = -0,028, т.
е. существенно выше, чем для большинства обычных буферных растворов.
88
Глава 1
1.11.3. Градиенты pH, возникающие при изменении диэлектрической
проницаемости среды и на границе раздела фаз
В работе Troitzki et al., 1974, 1975, описано образование градиента pH с
помощью обычных буферов в градиенте концентрации водно-органических
смесей, содержащих этанол, диок-сан, глицерин; маннитол, сахарозу или
сорбитол. Опираясь на изменения pH в зависимости от содержания
органического компонента, удавалось получать градиенты протяженностью
приблизительно в 1,5 ед. pH на различных участках шкалы pH. Градиенты
этого типа были стабильны при ИЭФ в течение па крайней мере 12 сут и при
напряжении до 1000 В. Было проведено разделение гемоглобинов кролика в
интервале pH 7-8,6, образованном боратным буфером в присутствии градиента
концентрации сахарозы 0-30% на 0,5%-ном глицерине, а также
фракционирование сывороточного альбумина человека в интервале pH 4,5-5,8
на основе ацетатного буфера в присутствии градиента концентрации
глицерина 0-90%.
На самом деле использовать градиенты такого типа была предложено еще в
работе Lundahl, Hjerten, 1973, где отмечалось, что при прохождении тока
через растворы, содержащие градиент концентрации неэлектролитов, например
сахарозы или даже акриламида (при градиентном электрофорезе), спонтанно
образуется градиент pH. Эти же авторы отмечали скачкообразное изменение
pH при переходе между буферным раствором и полиакриламидным гелем,
возможно вследствие изменения числа переноса ионов на границе жидкая
фаза/гель. На основании своих наблюдений они предложили интересное
объяснение такому известному явлению, как возникновение б- и е-границ при
электрофорезе в свободной фазе. По мнению авторов, эти границы
стационарны и соответствуют скачкообразному изменению pH и
электропроводности. Было предложено использовать аналогичные явления для
формирования стационарных градиентов; pH и проведения ИЭФ. Однако на
сегодняшний день возможность использования методов, основанных как на
изменении диэлектрической постоянной, так и на граничных эффектах,
представляется практически неосуществимой. По своему опыту работы как с
полиакриламидными гелями (неопубликованные данные, полученные совместно с
В. Brost и R. S. Snyder), так и с растворами (неопубликованные данные,
полученные совместно с М. Bier и N. Egen) могу отметить, что градиенты pH
этога типа (которые в лучшем случае квазистационарны) или слишком круты,
или слишком пологи для проведения ИЭФ.
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
89
1.11.4. Градиенты. pH, образуемые вследствие диффузии буферов
Градиенты этого типа уже кратко обсуждались в разд. 1.1 и 1.5.1. Свенссон
называл их "искусственными" градиентами pH, поскольку они образовывались
вследствие диффузии буферов с разными pH и быстро разрушались под
действием электрического поля. Разделяемую смесь помещали на границе
между кислым и щелочным буферными растворами в приборе, аналогичном
аппарату Тизелиуса. Градиент pH формировался благодаря диффузии в
электрическом поле (Kolin, 1954, 1955а,b, 1958). В такого рода
"искусственных" градиентах pH Колину удавалось получить "изоэлектрические
спектры" красителей, белков, клеток, бактерий и вирусов за времена от 40
с до нескольких минут, т. е. со скоростью, недостижимой для обычных
электрофоретических методов. Этот же прием был использован для разделения
сывороточных белков (Hoch, Barr, 1955) и гемоглобинов (Tuttle, 1956;
Maher et al., 1956). Из-за плохой воспроизводимости и нестабильности
метод не нашел применения и не использовался вплоть до 1979 г., когда был
предложен его модифицированный вариант (Pollack, 1979). В этом варианте
автор сделал еще один шаг вперед, отказавшись не только от амфолитов-
носителей, но и вообще от каких-либо буферных растворов. Фокусирование
проводилось в геле, содержащем только деионизованную воду между слабым
католитом (обычно 0,1 М трис pH 9,5) и слабым анолитом (0,1 М уксусная
кислота).
Можно ли считать это изоэлектрофокусированием? Несмотря на заверения
автора, мне представляется,что в данном случае разделение сводится просто
к распределению белковых зон на протяженных участках с практически
нулевой электропроводностью. В самом деле, если градиент pH и образуется,
то занимает не более 10% длины разделительной колонки. При этом к
катодному и анодному участкам примыкают широкие области с постоянным pH
(плато). Таким образом, в центральной части геля возникает ионный
"вакуум", нечто вроде омута, в котором и происходит захват белковых
ионов, неспособных к дальнейшей миграции. Аналогичное
