Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 34

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 28 29 30 31 32 33 < 34 > 35 36 37 38 39 40 .. 171 >> Следующая

ниже, поскольку при это'м все компоненты окажутся практически лишенными
заряда.
1.10Л0. Регенерация амфолитов-носителей
Возможность регенерации и повторного использования амфолитов-носителей,
особенно после препаративного ИЭФ, имеет важное практическое значение. С
этой целью было предложено использовать диализ (обычный или с применением
полых волокон), гель-фильтрацию, высаливание, ионообменную хромато-трафию
и электрофорез (Vesterberg, 1976; Callahan et al., 1976). В работе
Goerth, Radola, 1980, для выделения амфолитов-носи-телей была
использована ультрафильтрация через мембраны (производства Amicon и
Kalle), изготовленные из ацетата целлюлозы, полиамида или других
синтетических полимеров. Предложенная методика включала две стадии; на
первой проводилась ультрафильтрация через мембраны, задерживающие
молекулы с Мг=5000-20 000, на второй - через мембраны, задерживающие
молекулы с Мг = 500-5000. Таким способом в две стадии с достаточно
высокой скоростью можно регенерировать
ед
Глава 1
амфолиты-носители различных марок. Следует отметить, что полное отделение
амфолитов от сфокусированного белка происходит только при
ультрафильтрации через наиболее крупнопористую мембрану полиамидного типа
(РА 20 фирмы Kalle). Склонность к задерживанию на мембране увеличивается
в следующем ряду: сервалиты<амфолины<фармалиты. На этом основании в
работе Goerth, Radola, 1980, был сделан вывод о том, что амфолины и
фармалиты характеризуются более высокими значениями Мг. Впрочем,
последние данные (Bianchi Bosisio et al., 1981; Gelsema et al., 1980 a)
указывают, что амфолиты этих марок скорее всего просто более склонны к
агрегации (разд. 1.10.3). Интересно, что регенерация, судя по всему,
улучшает свойства амфолитов-носителей - они становятся более однородными
по размеру, уменьшается катодный дрейф при ИЭФ.
1.11. Альтернативные способы формирования градиента pH
В этом разделе будут рассмотрены некоторые другие методы, позволяющие
получать градиент pH, в принципе пригодный для ИЭФ. Некоторые из этих
методов представляют главным образом теоретический интерес, другие, как
утверждается, могут использоваться для изоэлектрического
фракционирования.
' 1.11.1 Амфолиты-носители на основе бактопептона
В работе Blanicky, Pihar, 1972, описано получение амфолитов из
бактопептона. После удаления белков осаждением 60%-ным этанолом получали
смесь, состоящую, вероятно, из нескольких десятков различных пептидов,
пригодную для проведения ИЭФ. Электропроводность и буферную емкость смеси
в нейтральной области повышали добавлением гистидина. Амфолиты-носители
этого типа аналогичны амфолитам, описанным в работе Vesterberg, Svensson,
1966, и обладают, по всей видимости, теми же недостатками. Подобный
подход был использован также в работе Molnarova, Sova, 1974, где с
помощью казеинового гидролизата удалось получить хороший градиент pH в
кислой области, начиная с pH 2,5.
1.11.2. Тепловой градиент pH
Принципиально иной подход к формированию градиента pH, не связанный ни с
использованием амфолитов-носителей, ни с длительным электролизом,
опирается на зависимость pH буфера и р! разделяемых белков от температуры
(Kolin, 1970; Luner,
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
87
Kolin, 1970, 1972; Lundhal, Hjertfin, 1973). Градиент pH, основанный на
температурной зависимости рК буфера, устанавливается за несколько секунд.
С помощью температурного градиента удается получить градиент pH на
участке протяженностью около 1 ед. pH. Форма градиента легко регулируется
изменением перепада температур. Преимущества данного метода заключаются в
том, что отпадает необходимость в проведении длительного стационарного
электролиза и использовании амфолитов-носителей, которые после ИЭФ нужно
каким-то образом отделять от белков.
В качестве примера рассмотрим равновесие в системе буфера трис-HCl,
которое определяет, его pH:
К=1Н+] [Трис]/[Трис-Н+]. (46)
Температурная зависимость активности протонов (ан) буферного раствора
может быть выражена как
дран/дТ " -(,д log К/дТ)- (2г+1) {д log у/дТ), (47)
где у - типичный коэффициент активности иона с валентностью z=l. В случае
трис-буфера второй член в правой части уравнения (47) по величине
составляет не более 10% от первого члена, следовательно, в первом
приближении им можно пренебречь. Первый член (dlnK/дТ) можно выразить
через молярную теплоту диссоциации кислоты {АН0) и универсальную газовую
постоянную (/?):
(д In К/дТ) = {АН0/RT2). (48)
Таким образом,
(dpaH/dT)^{AH°/RT>). (49)
Однако следует учитывать, что температура влияет не только на pH буфера,
но и на pi фокусируемого белка. Фокусирование может происходить только в
том случае, когда {дрН/дТ)бУф- {др1/дТ)белф0. На практике, однако,
подобные градиенты pH трудно использовать для ИЭФ, поскольку различия в
температурных коэффициентах для pH обычных буферов и для pi белков
оказываются недостаточно велики. Более того, как правило, значение дрН/дТ
для большинства буферных растворов слишком мало для того, чтобы
Предыдущая << 1 .. 28 29 30 31 32 33 < 34 > 35 36 37 38 39 40 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed