Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
сокомолекулярные компоненты. Наибольшее содержание таких компонентов,
выходящих в свободном объеме при гель-фильтра-ции на колонке с биогелем
Р-4, отмечалось для фармалитов pH 5-8. По-видимому, начиная с 1980 г.
высокомолекулярные компоненты были исключены из состава поступающих в
продажу препаратов фармалитов.
До недавнего времени данные об Мг для амфолитов-носителей какого-либо
определенного диапазона pH отсутствовали. Однако в работе Bianchi Bosisio
et al., 1981, при помощи осмо-метрического анализа разбавленных растворов
амфолитов, который, по мнению авторов, является наиболее совершенным
методом определения молекулярной массы, были найдены средние значения Мг
для амфолинов всех узких диапазонов pH. Эти данные представлены на рис.
1.19 и свидетельствуют о том, что масса амфолинов возрастает от
минимального значения 625 для щелочных компонентов (pH 8-10) до 910 для
кислых компонентов (pH 3,5-5). Амфолины двух крайних диапазонов (pH
2,5-4 и, вероятно, pH 9-11) характеризуются значительно меньшей
молекулярной массой (Л1г = 325). Это подтверждает
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
75
сделанное ранее предположение (Gelsema et al., 1980а) о том, что они не
принадлежат к "семейству" производных типа ПЭГА-акриловая кислота. Таким
образом, амфолины, по всей видимости, не содержат компонентов с Мт> 1000.
К сожалению, в случае фармалитов подобные эксперименты не могут быть
проведены, поскольку неизвестна их истинная концентрация в растворе
(фирма указывает только электропроводность для каждого диапазона pH).
1.10.4. Оптические свойства
Большинство компонентов, входящих в состав амфолинов, характеризуются
незначительным поглощением при 280 нм, что весьма удобно для регистрации
белков после фракционирования. Наиболее сильно в ультрафиолетовой области
поглощают амфолины с низкими значениями pi. Следует отметить, что в тех
случаях, когда регистрация поглощения производится не во фракциях,
полученных после ИЭФ в градиенте плотности, а непосредственно
сканированием колонки или геля в процессе ИЭФ, локальное поглощение того
или иного сфокусированного амфолита может оказаться весьма значительным
(Righetti, Drysdale, 1971; Catsimpoolas, 1973с).
При спектральном исследовании амфолинов различных диапазонов pH было
установлено, что большинство из них имеет спектр поглощения с максимумом
вблизи 365 нм (Righetti et al., 1975b). Амфолины диапазона pH 9-11 имеют
дополнительный максимум при 290 нм, а амфолины диапазона pH 3,5-5 сильно
поглощают при 310 нм. Кислые амфолины помимо заметного УФ-поглощения
отличаются также более интенсивной желтой окраской. Спектры поглощения и
флуоресценции некоторых хромофорных групп амфолитов (преимущественно
кислого диапазона) зависят от pH.
Характерные особенности спектров амфолинов связывали с гетероциклическими
азотсодержащими компонентами (Vinogradov et al., 1973; Righetti,
Drysdale., 1974). Однако присутствие подобных компонентов не удалось
выявить методом ЯМР-спект-роскопии (Righetti et al., 1975а).
Выпускаемые в настоящее время амфолины не дают спектров дисперсии
оптического вращения, что вполне согласуется с их химической структурой.
В препаратах крайних диапазонов-pH, выпускавшихся до 1970 г., содержались
компоненты, обладающие способностью поворачивать плоскость поляризации
света (Righetti et al., 1975b). Обнаруженная оптическая активность скорее
всего была связана с добавками аминокислот - Glu и Asp (в кислом
диапазоне pH), Lys и Arg (в щелочном диапазоне pH). Присутствие свободных
аминокислот отмечалось
78
Глава 1
также в работе Davies, 1970, и было подтверждено аминокислотным анализом
(Earland, Ramsden, 1969). После 1972 г. в поступающие в продажу амфолины
перестали добавлять свободные аминокислоты (Haglund, 1975).
Литературные данные об оптических свойствах сервалитов и фармалитов
весьма ограниченны. Они очень слабо поглощают при 280 нм, что позволяет
проводить прямое сканирование фракционируемых белков. В работе Williams,
Soderberg, 1979, приведены профили поглощения при 280 нм сфокусированных
фармалитов диапазонов pH 4-6,5; 5-8; 3-10. Наибольшие значения Л28о
характерны для наиболее кислых компонентов внутри каждого из диапазонов.
В диапазоне pH 4-6,5 поглощение отдельных пиков достигает 0,8.
Известно, что амфолины, сервалиты и фармалиты флуоресцируют при
возбуждении светом с длиной волны 254 и 365 нм (Bonitati, 1980, 1981).
Наиболее интенсивной флуоресценцией характеризуются сервалиты. Эта их
особенность была использована для построения профилей распределения
амфолитов и локализации белковых зон после ИЭФ (см. также разд. 1.8),
1.10.5. Буферная емкость и электропроводность амфолинов, сервалитов и
фармалитов
В литературе можно найти подробные сведения об амфолинах фирмр LKB
(Davies, 1970; Haglund, 1975; Fawcett, 1975а), а также об их аналогах,
синтезированных в лаборатории (Righetti et al., 1975а, 1977). Кроме того,
были опубликованы результаты сравнительного изучения амфолинов и
