Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
должен быть не уже 0,3 ед. pH (Charlionet et al., 1981).
Для получения небольших количеств амфолитов с узким рабочим диапазоном pH
фракционирование можно проводить в обычных колонках (110 и 440 мл) в
градиенте плотности (Vesterberg et al., 1967) или в слое гранулированного
геля (Radola, 1973 а, 1975). В работе Otavsky et al., 1977, разделение
проводилось в горизонтальной форме, заполненной смесью сефадекса и
певикона С870 (гранулы, изготовленные из поливинилхлорида и поливинил
ацетата). Для извлечения амфолитов после ИЭФ материал соответствующих
сегментов слоя центрифугировали через пористое стекло.
Особенно привлекательны проточные системы синтеза амфолитов (Just, 1980;
Righetti, Hjerten, 1981), при которых отбор фракций на выходе из
реакционной капиллярной спирали позволяет непосредственно получать наборы
амфолитов с узким диапазоном pH.
В принципе для фракционирования амфолитов можно использовать любой из
вариантов препаративного ИЭФ. В част-ности^описано разделение амфолитов в
полиэтиленовой капиллярной спирали (Macko, Stegemann, 1970) и в
тонкослойном проточном аппарате (Just et al., 1975 а, b). Оборудование, в
котором в качестве антиконвекционной среды используются системы, отличные
от капиллярных (например, гранулированный гель), выгодно применять в тех
случаях, когда нет необходимости отделять фракции амфолитов от инертного
носителя.
5*
68
Глава I
1.10. Основные свойства амфолитов-носителей
В этом разделе мы попытаемся обобщить имеющиеся на сегодня данные о
физико-химических свойствах амфолитов-носителей. Следует иметь в виду,
что эти данные относятся в основном к амфолинам, поскольку амфолиты этого
типа производятся (фирмой LKB) начиная уже с 1967 г. Будут рассмотрены
также отдельные свойства сервалитов и фармалитов. Основные свойства
амфолитов-носителей в обобщенном виде приведены в табл. 1.4 (Haglund,
1975).
Таблица 1.4. Свойства амфолинов и других амфолитов-носителей (по Haglund,
1975)
Фундаментальные "классические" свойства:
а) в изоэлектрической точке подвижность буферного иона равна нулю
б) хорошая электропроводность
в) хорошая буферная емкость Рабочие свойства:
а) хорошая растворимость
б) не мешают детектированию образцов
в) не влияют на свойства образцов
г) могут быть отделены от образцов Неблагоприятные свойства;
-а) проявление эффекта "плато", дрейф градиента pH
б) изменение химических свойств образцов
в) комплексообразование
1.10.1. Молярность и ионная сила амфолитов-носителей
Проведение опытов по ИЭФ заметно усложнялось из-за отсутствия данных о
молярности и ионной силе (/) в зонах сфокусированных амфолитов-носителей.
Единственный параметр, с надежностью поддающийся определению по окончании
ИЭФ как в сахарозном градиенте, так и в геле, - это pH. С другой стороны,
при электрофоретическом фракционировании все три названных выше физико-
химических параметра, которые определяют свойства разделяющей буферной
среды, точно известны экспериментатору. Ввиду этого вплоть до
сегодняшнего дня представлялось совершенно невозможным корректно
сопоставить данные, полученные независимо при. электрофорезе и при ИЭФ.
Незнание параметров среды порождало неопределенность при трактовке данных
ИЭФ, особенно в случае фракционирования клеток, pi которых, как известно,
существенным образом зависит от ионной силы среды (Sherbet, 1978)-
Однако недавно была продемонстрирована принципиальная возможность точного
определения молярности сфокусированных
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
69
амфолинов (McGuire et al., 1980). При фокусировании 1%-ного раствора
амфолинов в свободном потоке жидкости в проточном аппарате Ханнига
осмометрическое определение молярности в 48 элюируемых фракциях дало
значение 9-10 мМ для всего диапазона pH 3,5-10. Эта величина хорошо
согласуется с расчетным значением 15 мМ, полученным в работе Gelsema et
al., 1978, исходя из предполагаемого среднего значения мол. массы
амфолинов Мг = 700.
Величину ионной силы, которая при ИЭФ исчезающе мала, измерить
значительно сложнее. С самого начала было ясно, что классическое
определение ионной силы (Lewis, Randall, 1921)
7 = (1/2)2^, (35)
неприложимо к условиям ИЭФ. С другой стороны, все попытки непосредственно
измерить 7 при ИЭФ также оказались неудачными. Решение было найдено
(Righetti, 1980) с помощью ИЭФ эритроцитов, значение pi которых, как
известно, существенно зависит от ионной силы буферного раствора (Seaman,
1975). Графическое сопоставление данных электрофореза и ИЭФ эритроцитов
(см. рис. 1.18) и их экстраполяция дает значение 7=0,5 мг-ион/л для
сфокусированных 1%-ных амфолинов. Расчеты на основе теоретического
анализа и определения электропроводности также приводят к величине 7=0,5-
1 мг-ион/л. Были предложены следующие уравнения, связывающие ионную силу
(7) с молярностью сфокусированных амфолитов-носителей (СаМф) и
молярностью протонов (Сн) или гидроксилов (Сон) при данном значении pH:
7 = (1 /20)Самф-f-Сн в диапазоне рН2,5-7, (36)
