Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
охватывают все возможные подходы к синтезу амфолитов-носителей. Однако
это не совсем так. В частности, интересы нашей исследовательской группы в
течение ряда лет были связаны с ИЭФ пептидов (разд. 5.1). Несмотря на
значительные успехи в развитии аналитического ИЭФ пептидов, попытки
препаративного разделения не давали желаемых результатов. Оказалось, что
никакие методы, даже такие совершенные, как гидрофобная хроматография
(Gelsema et al., 1980 b), не позволяют полностью отделить небольшие
пентиды от примеси амфолитов-носителей. Для решения этой задачи можно
было бы попытаться использовать низкомолекулярные амфолиты (Gasparic,
Rosengren, 1974). Однако эти амфолиты перестали поступать в продажу;
кроме того, их также едва ли удалось бы полностью отделить от смеси
пептидов. К тому же, как показано в работе Charlionet et al., 1981, чем
меньше МГ амфолитов, тем ниже качество образуемого ими градиента pH. Это
следует и из расчетов, приведенных в работе Gelsema et al., 1979, которые
показали, что отношение молярной буферной емкости к электропроводности
амфолитов пропорционально кубическому корню из их молекулярной массы.
Мы решили подойти к проблеме препаративного разделения пептидов с
противоположной стороны, попытавшись использовать высокомолекулярные
амфолиты (Righetti, Hjerten, 1981). Вначале были опробованы два подхода.
Высокомолекулярные амфолиты получали, модифицируя акриловой кислотой
олигоамины, предварительно "пришитые" к растворимым декстранам {Mr в
диапазоне 10 000-20000). В другом варианте, проводя карбамилирование или
малеилирование альбумина и гемоглобина, получали набор компонентов с
разной степенью модификации и различными значениями pi в интервале 2-3
ед. pH. Ни один из этих подходов не принес успеха. В обоих случаях
полученные амфолиты содержали крайне мало буферных групп на
во
Глава 1
единицу молекулярной массы, что, как известно, отрицательно сказывается
на разрешающей способности при ИЭФ (Charlionet et al., 1981). Исходя из
этого, мы разработали способ синтеза амфолитов на основе
высокополимерного полиэтиленимина (ПЭИ) с Мг 40 000-60 000 и акриловой
кислоты. При проведении синтеза в стационарных условиях, аналогично
традиционной методике Вестерберга (разд. 1.7.1), оказалось, что
полученная смесь амфолитов содержит недостаточно компонентов со
значениями pi нейтральной области. Для устранения этого недостатка
пришлось применить модифицированную методику Джаста. Как показано на рис.
1.14, в проточной камере раствор ПЭИ смешивали с линейным градиентом
концентрации раствора акриловой кислоты. Идущую по трубке реакционную
смесь-делили на порции по 1 мл, периодически вводя пузырьки азота, и
направляли ее в термостатируемую капиллярную спираль. Б типичном опыте в
колбу помещали 50 мл 10%-ного ПЭИ, а в сосуды смесителя градиента -
резервуар (Р) и смеситель (С) - по 25 мл раствора акриловой кислоты с
концентрацией 18 и 2% соответственно. Градиент концентрации акриловой
кислоты был подобран таким образом, чтобы степень модификации аминогрупп
для амфолитов в щелочной области составляла около 10%, а кислой достигала
100%. После заполнения реакционной спирали ее перекрывали и
термостатировали 48 ч при 80 °С.
Г радиент акриловой кислоты
Рис. 1.14. Синтез высокополимерных амфолитов-носителей. 10%-ный раствор
полиэтиленимина смешивают с линейным градиентом концентрации (2-18%)
акриловой кислоты (магнит в смесителе вращается вокруг длинной оси).
Идущую по трубке реакционную смесь делят на порции по 1 мл с помощыа
пузырьков азота. После заполнения спирального капилляра реакционную смесь
инкубируют 48 ч при 80 °С. (Righetti, Hjerten, 1981.)
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
61
Полученные "гигантские" амфолиты-носители были успешно использованы для
препаративного разделения модельных дипептидов. Выход достигал 85%;
очищенные пептиды были свободны от примесей. Тем не менее
высокомолекулярные амфолиты этого типа имеют ряд недостатков - они весьма
склонны к агрегации и преципитации из-за образования множества ионных
связей, особенно при взаимодействии кислых и щелочных компонентов. Кроме
того, эти амфолиты, так же как и амфолиты обычных размеров,
характеризуются очень низкой электропроводностью на участке градиента , с
pH около 6. Таким образом, предположение о том, что увеличение Мг
амфолитов должно непременно сопровождаться повышением разрешающей
способности (Charlionet et al., 1981), в действительности является
ошибочным. По достижении некоторого значения Мг (по-видимому, начиная уже
с Мг 5000-6000) дальнейшее его увеличение не приводит к повышению
качества образуемого градиента pH. На самом деле, по данным Мюрела
(персональное сообщение), увеличение числа атомов азота в цепи свыше 12-
15 не сопровождается улучшением амфолитов-носителей.
1.8. Методы детектирования амфолитов-носителей
Можно назвать по крайней мере две задачи, для решения которых необходимо
располагать каким-либо методом обнаружения зон сфокусированных амфолитов.
