Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 22

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 16 17 18 19 20 21 < 22 > 23 24 25 26 27 28 .. 171 >> Следующая

величина общего изменения pH по длине разделительной колонки не может
быть меньше 0,3 ед. pH. Попытки понизить этот предел, используя в
качестве высокомолекулярных амфолитов набор продуктов сукдинилирования
бычьего сывороточного альбумина, оказались неудачными. Белки не могут
проявлять свойства хороших амфолитов-носителей, поскольку, как правило,
содержат слишком мало функциональных групп, диссоциированных при рН = р1,
и, следовательно, не обладают достаточной электропроводностью и буферной
емкостью. Значительное повышение рабочей концентрации белков также
невозможно ввиду опасности агрегации и преципитации в изоточке.
Можно допустить, что при использовании в качестве амфолитов-носителей
набора полиамино-поликарбоновых кислот, аналогичных амфолитам
Вестерберга, единственным фактором, ограничивающим разрешающую
способность, является Мт этих амфолитов, т. е., чем выше Мг, тем выше
должна быть разрешающая способность. Так, метод Шарлионе и др, позволяет
получать высокоэффективные амфолиты с Afr>5000 (Charlionet et al., 1979).
Тем не менее, как будет показано в разд. 1.7.4, высказанное выше
предположение на практике не подтверждается. Оказывается, что на самом
деле молекулярная масса хороших амфолитов-носителей не должна превышать
некоторого предельного значения.
1.7.3. Метод Джаста
В 1980 г. стал известен еще один вариант метода Вестерберга - синтез
амфолитов-носителей по Джасту (Just, 1980). Сообщения об этих, как мы их
одно время называли, "таинственных" амфолитах ("mysterious strain" -
Righetti et al., 1980) делались на каждом международном симпозиуме
начиная с 1976 г., однако подробности об их строении и способе получения
держались в тайне. В конце концов карты были открыты. Выяснилось, что и в
этом случае синтез основан на присоединении а-р-ненасыщенных соединений к
олигоэтиленолигоаминам, преимущественно к ПЭГА (источник этого 'реагента
по-прежнему держится в секрете). И все же ряд нововведений делают метод
58
Глава 1
20 40 60 80 МА, %
Рис. 1.13. А. Значения pH растворов синтетических амфолитов (после
омыления эфирных групп), полученных при различном процентном соотношении
исходных метанольных растворов: 4 М метилового эфира акриловой кислоты
(МА) и 1 М олигоаминов в реакционной смеси (см. список сокращений в
начале книги). Б. Шаблон для смесителя градиента типа Ultrograd (фирмы
LKB), использованный при синтезе амфолитов в диапазоне pi 3,5-10 на
основе ПЭГА. Для обеспечения постоянства содержания ПЭГА во всем
интервале значений pH при смещении в кислую область постепенно
увеличивали время реакции. На графике это отражается в постепенном
увеличении масштаба по оси pH (Оба рисунка заимствованы из работы Just,
1980.)
Джаста весьма примечательным. Во-первых, вместо акриловой кислоты
используется ее метиловый эфир. Во-вторых, реагенты перемешиваются в
проточной системе и с переменным молярным соотношением, которое задается
с помощью программируемого смесителя градиента типа Ultrograd (LKB).
Обычно в резервуары смесителя помещают 1 М ПЭГА и 4 М раствор
метилакрилата в метаноле. Реакция начинается при соотношении
ПЭГА/метилакрилат 80 : 20 в мольных процентах (образование основных
амфолитов) и заканчивается при соотношении 35:65 (образование кислых
амфолитов). На рис. 1.13,А показано распределение значений pH растворов
амфолитов-носителей, полученных на основе ПЭГА и других олигоаминов. На
рис.
1.13.5 изображен типичный шаблон для прибора Ultrograd, задающий
соотношение концентраций ПЭГА/метилакрилат. После смешивания реагенты
поступают в капиллярную колонку, термостатированную при 40 °С, и
перемещаются по ней в течение
1.5 ч. На выходе из колонки при помощи коллектора собирают фракции,
получая таким образом наборы амфолитов с узкими рабочими диапазонами pH
(на кривых, приведенных на рис. 1.13Л, точками отмечены границы семи
таких диапазонов). Для поддержания более или менее постоянного выхода при
синтезе амфолитов во всем диапазоне pH при переходе в область образования
кислых амфолитов понижение эквивалентной концентрации аминогрупп
компенсируют пропорциональным увеличением времени инкубации. Фактически
постоянно увеличивают время, затрачиваемое на образование амфолитов,
отвечающих
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
59
диапазону шириной в 1 ед. pH. На рис. 1.13 5 это отражено в виде
постепенного увеличения масштаба по оси pH. После отгонки метанола от
продуктов реакции проводят омыление эфирных групп в течение 2 ч при 120
°С. Использование метилакри-лата дает двойное преимущество: во-первых,
его реакционная способность намного выше, чем у акриловой кислоты (при
комнатной температуре время полуреакции 3,5 мин по сравнению с более чем
30 ч). Во-вторых, в метиловом эфире акриловой кислоты нет свободной
карбоксильной группы, поэтому он летуч и •его избыток может быть легко
удален перегонкой.
1.7.4. Высокомолекулярные амфолиты Ригетти - Хьертена
Может показаться, что методы, рассмотренные в предыдущих разделах,
Предыдущая << 1 .. 16 17 18 19 20 21 < 22 > 23 24 25 26 27 28 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed