Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
которые при ИЭФ формируют плавный стабильный градиент pH 3-9. Способ
синтеза заключался в присоединении акриловой кислоты к ряду полиаминов -
гексамети-лентетрамину (ГМТА), ТЭТА, ТЭПА и ПЭГА, взятым по отдельности
или в смеси (Righetti et al., 1975 а). Ниже приведены экспериментальные
детали этого синтеза.
Непосредственно перед использованием все олигоамины следует перегнать в
атмосфере азота. Вначале перегонка акриловой кислоты (содержащей около
20% л-метоксифенола) тоже проводилась в атмосфере азота, однако
впоследствии мы предпочли заменить азот на воздух. Дело в том, что в
атмосфере N2 при высокой температуре может начаться спонтанная
полимеризация с образованием олиго- и полиакриловых кислот. Кислород
воздуха, напротив, может играть роль ингибитора аутополимеризации.
Процесс перегонки ТЭТА, ТЭПА и акриловой кислоты не вызывает затруднений,
поскольку при пониженном давлении эти вещества обладают достаточно низкой
температурой кипения. Наиболее трудоемкой является перегонка ПЭГА,
проходящая при температурах 200-290 °С и давлении 500 мкм ртутного
столба.
Схема прибора для такой перегонки приведена на рис. 1.12, А. Необходимо
использовать азот самого высокого качества. Примеси кислорода,
содержащиеся в менее чистых препаратах азота, следует удалить
каталитическим выжиганием или пропусканием через соответствующий фильтр.
После очистки азот пропускают в раствор через очень тонкий капилляр,
достающий до дна колбы. Ввиду высокой вязкости ПЭГА при низкой
Рис. 1.12. А. Схема прибора для перегонки. 1-медная проволока,
нагреваемая в печи до 450 °С (для связывания примеси 02), 2 - змеевик
охлаждения, 3 - перегонная колба, 4 - капилляр для пропускания азота, 5 -
дефлегматор, 6 - термометр, 7 - холодильник, 8 - приемные колбы, 9 -
ловушка с концентрированной H2SO4, 10 - ловушка с СаС12, 11-к вакуумному
насосу. Заштрихованы места соединения на шлифах. (Righetti et aL, 1975а.)
Б. Прибор для синтеза амфолитов-носителей. 1 - магнитная мешалка, 2 -
капилляр для пропускания азота, 3 - раствор полиамина, 4 - раствор
акриловой кислоты в капельной воронке с боковым отводом, 5 -
хлоркальциевая газоотводная трубка. (Gianazza Е., Righetti P. G.,
неопубликованные данные.)
54
Глава Г
, температуре для перегонки следует использовать только воздушный
холодильник. Пониженное давление в системе создается вакуумным насосом,
присоединенным к приемнику через ловушку с концентрированной H2SO4 (для
поглощения паров аминов) и через расположенную ближе к насосу ловушку с
осушителем. Пары воды можно также вымораживать в ловушке с сухим льдом.
Синтез следует проводить сразу же после очистки реагентов. Акриловую
кислоту лучше перегонять в последнюю очередь, так как после удаления
ингибитора (метоксифенола) она немедленно начинает полимеризоваться.
Избыток акриловой кислоты можно хранить в замороженном виде, желательно
при - 80°С или в жидком азоте.
Для проведения реакции полиамины и акриловую кислоту, взятые в
определенной пропорции, помещают в прибор, изображенный на рис. 1.12, Б.
Он состоит из двугорлой колбы, в которой находится 1,5 М раствор
полиаминов р воде. Колба снабжена капилляром для пропускания азота и
бюреткой, в которой находится акриловая кислота. В бюретку впаяна
стеклянная трубка для выведения азота из колбы и обеспечения инертной
атмосферы азота в самой бюретке. Акриловую кислоту добавляют по каплям до
достижения молярного соотношения аминогрупп и карбоксильных групп 2:1,
перемешивая реакционную смесь при помощи магнитной мешалки. Затем колбу
закрывают и выдерживают при 70 °С на качалке в течение 16-20 часов.
Реакция может быть представлена следующей схемой:
Н20, 70 °С, 16-20 ч
ГМТА + ТЭТА + ТЭПА + ПЭГА + Акриловая кислота------------------>
*¦ Смесь амфолитов-носителей
Полученные амфолиты разбавляют до концентрации 40% и хранят в
замороженном виде во флаконах из темного стекла. Компоненты, придающие
раствору желтую окраску, можно удалить обработкой активированным углем
(Vinogradov et al., 1973). Однако это не всегда необходимо: окрашенные
соединения тоже являются амфолитами и могут служить как бы "внутренними"
маркерами для контроля за формированием градиента pH. С другой стороны,
даже если при аналитическом ИЭФ окрашенные амфолиты не препятствуют
разделению и детектированию белков, в препаративных вариантах, особенно
при ИЭФ в градиенте плотности раствора сахарозы, присутствующие в системе
окрашенные амфолиты могут оказаться помехой.
По ряду критериев амфолиты, полученные согласно описанной выше методике,
практически эквивалентны имеющимся в продаже препаратам и отличаются
главным образом только сравнительно высоким поглощением при 315 и 368 нм
(Righetti
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
55
et al., 1975 а). Исходные реагенты для синтеза таких амфолитов
легкодоступны, сам синтез прост в исполнении и позволяет за короткое
время получать значительные количества продукта. Следует, однако,
отметить, что сейчас многие олигоамины (в том числе и ПЭГА, дающий
