Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
амфолитов-носителей. По утверждению фирмы, поступающие в продажу
фармалиты характеризуются равномерным распределением буферной емкости и
столь же равномерным распределением электропроводности на достаточно
низком уровне по всему градиенту pH. Независимым образом это
подтверждается в работе Gelsema et al., 1979.
Равномерного распределения электропроводности и буферной емкости при ИЭФ
можно добиться, только располагая крайне гетерогенным набором
синтетических амфолитов-носителей с близкими значениями рК и pi,
распределенными с очень высокой частотой по всему рабочему диапазону pH.
Поскольку при синтезе фармалитов с узким диапазоном pi используется смесь
семи разных аминов, а продукты сополимеризации с эпихлор-гидрином
содержат в среднем по шесть аминогрупп, в результате, как подсказывает
логика, может быть получен довольно ограниченный набор различных
амфолитов. Однако этот набор может быть расширен при использовании в
качестве исходных компонентов стереоизомеров. Так, применение D, L-
эпихлоргид-рина, D, L-аминов и D, L-аминокислот позволяет значительно
увеличить возможное число комбинаций.
Полученные диастереомеры, в отличие от энантиомеров, проявляют заметные
(пусть и не очень большие) различия в значениях pH. в действительности
разнообразие молекулярных форм возрастает также за счет дополнительного
образования пента- и гексамеров, а также разветвленных и циклических
производных. По некоторым оценкам, фармалиты содержат около 1000
различных компонентов на единицу pH. Поскольку амфо-
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
51
литы-носители Вестерберга содержали лишь около 100 компо-нентов на
единицу pH (Radola et al., 1977), появление амфолитов нового типа
означает увеличение степени гетерогенности & популяции не менее чем на
порядок.
В структуре фармалитов преобладают третичные аминогруппы, как правило
соседствующие с p-гидроксильными группами. Исходя из степени
полимеризации (6 остатков аминов и 5 остатков эпихлоргидрина), можно
сделать вывод, что их мол. масса (Мг) должна достигать 750-800. Это
заметно выше, чем значение Мг, полученное на основании данных гель-
фильтрации (около 450 дальтон). Несмотря на значительную молекулярную
массу, фармалиты имеют довольно компактную пространственную структуру,
по-видимому за счет образования внутримолекулярных водородных связей.
Основными типами буферных групп фармалитов являются: а-аминокарбоксильные
группы (pH 2-3),. остатки диглицина (pH 3-4), р-гидроксиэтиламиногруппы
(pH 4-9) и диалкиламинопропильные группы (pH 9-11).
1.7. Синтез амфолитов-носителей в лаборатории
Итак, на сегодняшний день в продажу поступают в основном амфолиты-
носители трех типов: амфолины фирмы LKB, сервалиты фирмы Serva и
фармалиты фирмы Pharmacia. Несмотря на определенные химические различия
между этими ам-фолитами, в основе методов их получения лежит все тот же
принцип Вестерберга. В качестве исходных компонентов используют полиамины
(или полиаминокислоты), а также органические и (или) неорганические
кислоты. Синтез проводят таким образом, чтобы получить максимально
гетерогенную смесь амфолитов. Для выделения фракций с узким рабочим
диапазоном pH эту смесь в дальнейшем подвергают ИЭФ. Различные наборы
амфолитов с узким диапазоном pi можно получить и непосредственно,
подбирая соответствующие исходные вещества и условия синтеза.
Одновременно с тем, как конкурирующие фирмы стремились повысить качество
выпускаемой ими продукции, ученые направляли свои усилия на поиски
оптимальных методов получения амфолитов-носителей. Эти поиски оказались
весьма успешными еще и потому, что в отличие от фирм-конкурентов, не
раскрывающих технологических деталей своего производства, ученые
стремятся как можно шире обсуждать и распространять сведения, которыми
они располагают.
Благодаря исследованиям, проводившимся в течение ряда лет в различных
научных лабораториях, удалось разработать новые эффективные методы
получения амфолитов для ИЭФ. Новые варианты синтеза по-прежнему основаны
на принципе
4*
52
Глава 1
Вестерберга, и все же можно с уверенностью сказать, что сегодня наши
знания в области химии амфолитов стали значительно шире.
1.7.1. Метод Виноградова - Ригетти
В работе Vinogradov et al., 1973, было показано, что методику Вестерберга
можно воспроизвести с помощью обычного лабораторного оборудования.
Присоединением остатка акриловой кислоты к ПЭГА были получены амфолиты,
пригодные для ИЭФ в области pH 4-8. По большинству параметров они
удовлетворяли соответствующим требованиям, а единственный их недостаток
заключался в неравномерном распределении электропроводности по градиенту
pH. Эти опыты продемонстрировали, что амфолиты для ИЭФ относительно легко
получить в лаборатории. В той же работе был описан метод оптического
детектирования сфокусированных амфолитов, позволяющий контролировать их
распределение при ИЭФ.
Опираясь на эти результаты, Ригетти и др. удалось синтезировать амфолиты,
