Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
Таблица 1. 2. Потенциальные амфолиты-носители для ИЭФ (расположены в
порядке возрастания р!) (Svensson, 1962а)
Амфолит pi pi-p/Ci
Аспарагиновая кислота Глутатион Аспартилтирозин о-Аминофениларсоновая
кислота Аспартиласпарагиновая кислота /i-Аминофениларсоновая кислота
Пиколиновая кислота L-глутаминовая кислота р- Г идроксиглутаминовая
кислота Аспартилглицин Изоникотиновая кислота Никотиновая кислота ,
Антраниловая кислота гс-Аминобензойная кислота Глициласларагиновая
кислота -и-Амннобензойная кислота Дийодтирозии Цистинилдиглицин а-
Гидроксиаспарагиновая кислота а-Аспартилгистидин Р-Аспартилгистидин
Цистеинилцистеин Пентаглицин Тетраглицин Триглицин Тирозилтирозин
Изоглутамин
Лизилглутаминовая кислота
Гистидилглицин
Г истидилгистидин
Гистидин
L-метилгистидин
Карнозин
а,р-Диаминопропионовап кислота Ансерин (метнлкарпозии) Тирозиларпшин
т -ормитин
Лизин
Л"чиллизпн
"ИНИН
2,77 0,89
2,82 0,70
2,85 0,72
3,00 (?) 0,77 (?)
3,04 0,34
3,15 (?) 0,92 (?)
3,16 2,15
3,22 1,03
3,29 0,96
3,31 1,21
3,35 1,51
3,44 ' 1,37
3,51 1,47
3,62 1,30
3,63 0,82
3,93 0,81
4,29 2,17
4,74 1,62
4,74 2,43
4,92 1,90
4,94 2,00
4,96 2,31
5,32 2,27
5,40 2,35
5,59 2,33
5,60 2,08
5,85 2,04
6,10 1,65
6,81 1,00
7,30 0,50
7,47 1,50
7,67 1,19
8,17 1,34
8,20 1,40
8,27 1,23
8,38 (?) 1,00 (?)
8,68 (?) 1,13 (?)
9 70 1,05
°,74 0,79
10,04 0,59
10,76 1,72
44
Глава 1
лротеолиза смесь пептидов обессоливали и фракционировали при помощи
стационарного электролиза в 20-камерном аппарате. Применение полученных
таким образом препаратов для ИЭФ позволяло разделять белки, изоточки
которых различались на 0,1 ед. pH (Vesterberg, Svensson, 1966). Однако и
этот подход был не лишен недостатков. Пептидные препараты были окрашены,
а кроме того, фракции олигопептидов, фокусирующихся при pH 5,0-^-6,5,
проявляли свойства плохих амфолитов-носителей.
Переломным моментом в истории ИЭФ можно считать 26 августа 1964 г., когда
Олаф Альфред Ингве Вестерберг (для друзей - просто Олаф) оформил шведский
патент на способ синтеза амфолитов-носителей для ИЭФ. (Более доступный
англоязычный вариант описания изобретения можно найти в американском
патенте № 3485736, выданном 23 декабря 1969 г.). Только с этого момента
начинается период подлинного расцвета метода ИЭФ.
1.6.1. Синтез амфолинов (фирма LK.B)
Основные данные по этой теме содержатся в работах Vesterberg, 1969а, b;
Haglund, 1975; Davies, 1970, и Gasparic, Rosen gren, 1974, 1975. Несмотря
на то что прямо это никем не отмечалось, ясно, что имеющиеся в продаже
амфолины - это и есть амфолиты-носители, впервые синтезированные и
запатентованные Вестербергом. Как об этом сказано в патенте, амфолины
представляют собой "полиаминополикарбоновые кислоты; каждая из них
содержит не менее четырех слабых протолити-ческих групп, в том числе по
крайней мере одну карбоксильную группу и одну замещенную аминогруппу. Эти
соединения не содержат пептидных связей".
Каким же образом Вестербергу удалось разработать столь совершенную - даже
по сегодняшним меркам - и вместе с тем простую систему? Направление
поиска задавала теория Свенссона: значения pi, а следовательно, и
значения рК амфолитов-носителей должны быть равномерно распределены по
всему диапазону pH 3-10. В алифатических соединениях, содержащих только
одну карбоксильную группу или одну аминогруппу, диссоциация этих групп
происходит, как правило, при pH 4-5 и pH 9-10 соответственно. Однако
олиго- и полиамины, особенно такие, в которых все аминогруппы разделены
этиленовыми звеньями, характеризуются целым набором значений р/С- При
этом оказывается, что, чем больше аминогрупп содержится в олигоамине, тем
шире спектр соответствующих значений рК (см. табл. 1.3). Показано, что в
высшем из доступных на сегодня олигоаминов такого типа - пентаэтилен-
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
45
Таблица 1.3. Константы диссоциации этиленаминов^
Амины PKi РК2 РАз Р*4 PKi т, °с
Этилендиамин Ю,1 7,0 20
Диэтилентриамин 9,9 9,1 4,3 20
Т риэтилентетрамин 9,9 9,2 6,7 з,з 20
Тетраэтиленпентамин 9,9 9,1 7,9 4,3 2,7 25
*) Vesterberg, 1969b,
гексамине (ПЭГА) - значение р/Се приближается к 1,1 (Righetti et al.,
1975 а).
Исходя из этого, Вестерберг сделал вывод, что подходящие амфолиты-
носители могут быть получены на основе таких олигоаминов, как
этилендиамин, диэтилентриамин, триэтилентетра-мин (ТЭТА),
тетраэтиленпентамин (ТЭПА), ПЭГА и их смесей. В качестве присоединяемого
карбоксильного компонента он использовал а, p-ненасыщенные карбоновые
кислоты, преимущественно содержащие не более 10 атомов углерода в цепи.
Помимо одноосновных кислот - акриловой, метакриловой и кротоновой - было
предложено использовать и дикарбоновые ненасыщенные кислоты, например
малеиновую или итаконовую. Синтез можно проводить, исходя из
индивидуальных кислот или из их смесей. Имеющиеся в продаже амфолины, по-
видимому, содержат производные только одной, акриловой, кислоты.
Способ синтеза основан на методике, предложенной еще в работе Engel,
