Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
состояние
кгс 25 вС 10 вС 25 °С 10°С 25 °С при комнатной температуре
Кислоты с буферными карбоксильными группами
Иммобилин р/С 3,6 Иммобилин р/С 4,39 Иммобилин р/С 4,6 3,57 4,39 4,60
3,58 4,39 4,61 4,30±0,02 4,51 ±0,02 4,36±0,02 4,61 ±0,02
3,68±0,02 4,40±0,03 4,61 ±0,02 3,75±0,02 4,47 ±0,03 4,71 ±0,03
Твердое " "
Основания с буферными третичными аминогруппами
Иммобилин р/С 6,2 Иммобилин р/С 7,0 Иммобилин р/С 8,5 Иммобилин р/С 9,3
6,41 7,12 8,96 9,64 6,23 6,97 8,53 9,28 6,21 ±0,05 7,06±0,07
8,50±0,06 9,59±0,08 6,15±0,03 6,96±0,05 8,38±0,06 9,31±0,07 6,32±0,08
7,08±0,07 8,66±0,09 9,57 ±0,06 6,24±0,07 6,95±0,06 8,45±0,07 9,30±0,05
" Жидкое
¦) По Bjellqvist et al., 1982а. г) Значения р/С измерены с помощью
стеклянного электрода без введения поправок. 3) Средние значения,
полуденные на основании 10 независимых измерений. В случае аминогрупп
точность определения р/С невысока ввиду медленного ответа электрода.
366
Глава 5
ферного компонента в системе будет реализоваться градиент pH,
соответствующий аналогичному участку кривой титрования буферного
иммобилина. Поэтому оптимальным в отношении линейности и буферной емкости
будет градиент, центральный участок которого соответствует точке перегиба
на кривой титрования (т. е. рК буферного компонента). В этом случае при
протяженности иммобилизованного градиента в 0,4 ед. pH отклонение от
строгой линейности не превысит ±5%. На практике можно пользоваться и
подобными градиентами протяженностью до 1,2 ед. pH, при условии
совпадения pH в центре градиента с рК буферного компонента. Однако в этом
случае по краям градиента pH будут наблюдаться определенные отклонения от
линейности. Если же мы будем линейно изменять концентрацию
Расстояние (в условных единицах)
Рис, 5.23. Образование градиентов pH при линейном градиентном смешивании
двух иммобилиновых компонентов, один из которых обладает, а другой не
обладает буферными свойствами в данной области pH. 1 - кривая титрования,
точка перегиба которой совпадает с рК буферного иона; 2 - кривая с точкой
перегиба, соответствующей значению р/С+0,3 ед. pH; 3 - кривая с точкой
перегиба при рН=р^+0,6 ед. pH; 4 - кривая с точкой перегиба при рН=рК- -
0,3 ед. pH; 5-кривая с точкой перегиба при рН = р/(-0,6 ед. pH.
(Bjellqvist
et al., 1982.)
Некоторые применения метода ИЭФ
367
Рис. 5.24. ИЭФ гемоглобинов С и Аг в обычном градиенте pH 6-9 (вверху) и
в иммобилизованном градиенте pH 7,7-8,2 в системе иммобилинов (внизу).
НЬС был получен от гомозиготного донора, а НЬА2 был выделен из крови
нормального взрослого донора и очищен с помощью хроматографии. В обоих
случаях катод расположен сверху. (Неопубликованные результаты Gianazza,
Righetti.)
буферного компонента, то точка перегиба на кривей титрования будет
смещаться в более кислую или в более щелочную область, т. е. в
направлении достижения нового положения эквивалентности. В этом случае мы
получим семейство параллельных кривых титрования со смещением вдоль оси
pH, достигающим 1,2 ед. pH, при сохранении приемлемых диапазонов
линейности (соответствующая рабочая область на рис. 5.23 заключена в
рамку).
Каким же образом все это осуществляется на практике? Допустим, что вы
хотите сфркусировать гемоглобины. В этом слу-
368
Глава 5
чае лучше всего выбрать иммобилин р/С 7.0 и приготовить тяжелый и легкий
градиентные растворы, содержащие этот буферный компонент в концентрации
10 мМ. Затем с помощью иебуферноЛ) компонента (например, иммобилина р/С
3,6) оттитровать тяжелый градиентный раствор до pH 6,6, а легкий - до pH
7,6. После этого форму для полимеризации заполняют линейным градиентом
плотности (и соответственно pH). Заполи-меризованный гель будет содержать
иммобилизованный, практически линейный градиент pH в интервале pH 6,6-7,6
(идеальные условия для разделения большинства гемоглобиновых компонентов;
см. рис. 5.12). В отличие от градиентов Свенссо-на этот градиент
образуется не под действием электрического поля, а формируется
предварительно. Однако в отличие от градиентов Колина при пропускании
тока этот градиент сколь угодно долго остается неизменным. (Кстати, не
забудьте пометить полярность приготовленного геля, чтобы затем с
уверенностью поместить анод со стороны кислых значений pH, а катод - со
стороны щелочных.)
Итак, мы снова вернулись к тому, с чего все и начиналось? Можно считать,
что 1982 г. ознаменовал второе рождение метода ИЭФ. Смелее же вперед,
постарайтесь не упустить свой шанс! P.S.: Приглашаю всех скептиков
взглянуть на рис. 5.24, и, я уверен, они заговорят по-другому.
ЛИТЕРАТУРА
Ackers G. К. (1964). Biochemistry, 3, 723-730.
Ackers G. K. (1967). J. Biol. Chem., 242, 3237-3241.
Addison G. M.t Beamish Af. R.t Hales C. N., Hodgkins Af. R.t Jacobs A.,
LeeweU len P. (1972). J. Clin. Pathol., 25, 326-333.
Ahlgren E., Eriksson K. E" Vesterberg 0. (1967). Acta Chem. Scand., 21,
937- 944.
Akedo H.t Mori Y.t Kobayashi М., Okada Af. (1972). Biochem. Biophys. Res.
