Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
талассемии, наследственной пер-систенции гемоглобина F и лейкемии
(Weatherall et al., 1974). Третий важный для диагностики минорный
компонент - это HbAic, т. е. гликозилированный НЬА, уровень которого
значительно повышается при сахарном диабете (Rahbar, 1968). Точное
количественное определение уровня HbAic представляет большой интерес,
поскольку оно может послужить оптимальным способом установления и
перманентного контроля за степенью развития гипергликемии (Gabbay, 1976).
В 1978 г. было опубликовано не менее четырех работ по разделению и
количественному определению НЬА и НЬА]С с помощью ИЭФ (Schoos et al.,
1978; Spicer et al., 1978; Jeppsson et al., 1978; Beccaria et al., 1978).
Поскольку различие в значениях pi этих компонентов крайне незначительное,
для их фракционирования приходилось дополнительно вводить в гель
"разделители", такие, как р-ала-нин или дипептид His-Gly. Однако и в этом
случае расстояние
Некоторые применения метода ИЭФ
363
Рис. 5.22. ИЭФ в иммобилизованном градиенте pH (в системе иммобилинов pH
6,5-7,5) гемолизатов, полученных от взрослых, больных сахарным диабетом.
Фокусирование проводили в течение ночи при напряжении 200 В/см. При
высокой загрузке образцом - около 300 мкг гемоглобина на трек -
поперечная диффузия приводит к тому, что белковые полосы из отдельных
треков сливаются в одну непрерывную линию. Гель изображен катодной
областью вверх.
(Из неопубликованных результатов Gianazza, Righetti.)
между двумя соответствующими полосами едва достигало 1 мм, что сильно
осложняло их количественное определение с помощью обычных сканирующих
денситометров. Значительно более высокое разрешение этих компонентов
достигается при ИЭФ в иммобилизованном градиенте pH. Как показано на рис.
5.22, расстояние между полосами составляет несколько миллиметров, и этого
уже вполне достаточно для их достоверного денситомет-рирования.
5.5. Иммобилины с этим справятся!
Вы просто не поверите, как я рад, что эта запутанная история наконец-то
близка к завершению. Закончить ее мне бы хотелось, устремив в будущее
взгляд, полный светлой надежды. Вам надоели эти "дрейфующие" градиенты
pH? Вы расстроены из-за бесконечных флуктуаций в расположении* белковых
пятен на двумерной карте? Вас раздражают неистребимые "провалы" в
электропроводности и буферной емкости? А как вам нравятся эти
деформированные волнообразные зоны? Воспряньте духом - иммобилины с этим
справятся! Помните, у нас как-то зашел разговор о том, что если с
иммобилизованными градиентами pH ничего не выйдет, то вам придется сжечь
свой экземпляр книги? Считайте, что вам повезло: этого вам делать не
придется. На сегодняшний день в продаже имеется
364
Глава 5
семь различных компонентов системы иммобилинов (Immobili-пе(r)). Значения
р/С этих компонентов в свободном растворе и в составе геля приведены в
табл. 5.3. Все эти соединения являются производными акриламида с общей
формулой
СН.=С-С- N-R I II I НОН
где в состав радикала R входит карбоксильная группа или третичная
аминогруппа. В процессе полимеризации буферные компоненты эффективно
встраиваются в гель. Расстояние между двойной связью и буферной
функциональной группой достаточно велико - настолько, что влиянием
двойной связи на константу диссоциации в исходных мономерах можно
пренебречь. Таким образом, различия в значениях р/С свободных и связанных
с матрицей иммобилинов определяются главным образом влиянием самой
матрицы. На величины р/С буферных групп в геле влияют также изменения
температуры в ходе ИЭФ. Формирование иммобилизованного градиента pH
основано на том же принципе, что и приготовление обычных градиентных
полиакриламидных гелей. Для стабилизации нужного градиента концентрации
иммобилинов используют поддерживающий градиент плотности (см., например,
рис. 3.33, изображающий типичную систему заливки градиентного геля). В
случае получения иммобилизованного градиента pH, как правило, лучше
использовать не экспоненциальный, а линейный градиент концентрации
иммобилинов. Рассмотрим простой пример: образование градиента pH с
использованием двух иммобилиновых компонентов - одного буферного и одного
небуферного (ионного). В этом случае, рассматривая второй компонент как
полностью ионизированный и зная рК буферного (первого) компонента и
молярное соотношение между компонентами в растворе, значение pH раствора
можно рассчитать по уравнению Ген-дерсона-Хассельбалха. Так, если
буферным компонентом является кислота (А), а Сд и С в - молярные
концентрации кислого и основного иммобилинов соответственно, то значение
pH будет определяться как
PH=P*A+log с!%сГ-В случае буферного основания уравнение примет вид
pH = p/CB+l°g -Bqa а •
Если концентрация буферного компонента остается неизменной, то при
линейном изменении количества нейтрализующего небу-
Таблица 5.3. Свойства иммобилинов1 >. Значения рК*> (/= 10-2)
н2о Полиакриламидный гель8) Г"5%, С-3%
Полиакриламидный гель Г"5%. С=3%, 25%-ный глицерин Агрегатное
