Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
двухвалентных амфолитов с одинаковыми значениями коэффициента диффузии и
электрофоретической подвижности. Величины, отложенные по осям абсцисс
(*/М) и по левым осям ординат, имеют размерность моль/литр. Сплошная
прямая Н - электропроводность, прерывистая линия - градиент pH. Д.
Фокусирование восьми амфолитов-носителей со значениями Др/(=2 и с
изоточками, различающимися на Др/=0,05, в диапазоне 0,25 ед. pH. Б.
Фокусирование восьми амфолитов-носителей со значениями Др/С-2 и с
изоточками, различающимися на Др/=0,1, в диапазоне 0,5 ед. pH. В.
Фокусирование семи амфолитов-носителей со значениями Др/( = 4 и Др/=0,3.
Плавный градиент образуется только в случае Л. (Almgren, 1971.)
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
41
В качестве третьего примера выбран неудачный во всех отношениях набор
амфолитов с Ар/С=4 и Др1 = 0,3. В такой системе будет наблюдаться
ступенчатое изменение pH и неравномерное распределение электропроводности
(рис. 1.9,5). Минимумы электропроводности располагаются в центральной
части каждой зоны (соответствуют плато на градиенте pH), а максимумы - на
границах между зонами. Здесь, так же как на рис.
1.9,5, зона каждого амфолита пересекается только со своими ближайшими
соседями; при приближении к центру соседней зоны концентрация данного
амфолита стремится к нулю. Образование таких зон, примерно вдвое более
узких, чем в предыдущем примере, может происходить только при очень
высоком напряжении, поскольку для амфолитов с ДрК=4 зависимость
подвижности от pH вблизи изоточки имеет значительно более пологий
характер, чем в случае хороших амфолитов.
Проведение такого теоретического анализа позволяет сделать ряд выводов,
важных в практическом отношении. В первую очередь удается оценить
минимальное число амфолитов-носителей, необходимое для образования
плавного градиента pH, - не менее 30 на единицу pH. Кроме того,
оказывается, что при очень высоком падении напряжения (фирма Pharmacia
рекомендует использовать 250-300 В/см, а в работе Kinzkofer, Radola,
1981, ИЭФ проводили в мини-гелях при 400-700 В/см) существует серьезная
опасность, что даже хорошие амфолиты, фокусируясь в слишком узкие зоны,
не смогут обеспечить равномерного распределения электропроводности. В
системе возникнут локальные минимумы электропроводности, которые могут
вызывать избыточное выделение тепла и соответственно термоденатурацию
лабильных белков.
42
Глава 1
1.6. Синтез амфолитов торговых марок
Теоретические основы современного ИЭФ, как нам уже известно, были
разработаны в серии статей под общим названием "Изоэлектрическое
фракционирование. Анализ и характеристика амфолитов, образующих
естественные градиенты pH (Svensson, 1961, 1962а, b; Rilbe, 1973а).
Однако проведенное Свенссоном'тщательное изучение химических каталогов в
поисках имеющихся в продаже амфолитов, пригодных для ИЭФ, т. е.
обладающих хорошей проводимостью и высокой буферной емкостью вблизи
изоточки (рI-р/С< 1,5), дало не очень обнадеживающие результаты. Перечень
таких амфолитов приведен в табл. 1.2 (Svensson, 1962а). При составлении
этого перечня амфолиты с (р/-р/С) >2,5 считали непригодными для ИЭФ.
Соединения, для которых этот параметр находится в диапазоне от 1,5 до
2,5, были включены в список, но расценивались как плохие амфолиты-
носители. Из табл. 1.2 видно, что в области pH 5-7 амфолиты,
удовлетворяющие соответствующим требованиям, практически отсутствуют.
Настоящая таблица приведена главным образом для того, чтобы
проиллюстрировать, насколько сложным и трудоемким (как в теоретическом,
так и в практическом отношении) оказался процесс "вынашивания" метода
ИЭФ. Кроме того, некоторые из перечисленных в таблице соединений
используются в одной из модификаций обычного метода ИЭФ. Эта модификация
была первоначально названа "разделительным ИЭФ" (Caspers et al., 1977), а
затем переименована в "ИЭФ в модифицированном градиенте pH" (Beccaria et
al., 1978). Сущность подхода сводится к расширению одного определенного
участка на градиенте pH, образованном обычными амфолитами-носите-лями
Вестерберга, путем добавления соответствующих амфолитов из приведенного
списка. Подобные амфолиты сами по себе не подходят для ИЭФ, но при
использовании в качестве дополнительных компонентов они позволяют при
необходимости значительно повысить разрешение вблизи определенных
значений pH (см. также разд. 4.1.1).
Исследования, отраженные в табл. 1.2, проводились в Химической
лаборатории Гейтса и Креллина, в Калифорнийском Технологическом
институте, в лаборатории Л. Полинга. По возвращении в Стокгольм Свенссон
продолжил поиски в другом направлении. Было решено, что в качестве
амфолитов, пригодных для разделения белков методом ИЭФ, могут быть
использованы короткие пептиды. Поначалу применялся казеиновый гидролизат
(Svensson, 1962 b), затем предпочтение было отдано гидролизату
гемоглобина или суммарного белка крови ввиду повышенного содержания
гистидина в гемоглобине. После
