Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
Если градиент pH образован небольшим числом амфолитов-носителей (от 5 до
10 различных амфолитов на единицу pH) с достаточно высокими значениями
ДрК, то характер изменения pH внутри такого градиента оказывается
ступенчатым. Для того чтобы ответить на вопрос, сколько разных амфолитов-
носителей необходимо для образования плавного градиента, достаточно
сформулировать условие слияния двух соседних зон амфолитов в одну
непрерывную зону. Как показано в работе Svensson, 1966, сумма двух
одинаковых гауссовых кривых дает одну кривую с максимумом в виде широкого
плато тогда, когда исходное расстояние между двумя максимумами меньше или
равно удвоенному стандартному отклонению. В этом случае, т. е. при полном
отсутствии разрешения между любыми соседними зонами амфолитов, следует
ожидать плавного изменения pH по всему градиенту. Таким образом,
максимальное различие между значениями pi примыкающих друг к другу
амфолитов-носителей, удовлетворяющее сформулированному критерию,
определяется неравенством
¦ (34)
Это неравенство [полученное исходя из уравнения (23)] полностью
согласуется с выводами, сделанными в работе Almgren, 3971. Параметр s
характеризует качество амфолитов: чем меньше значение s, тем лучше
электропроводность и буферная емкость. Из неравенства (34) следует, что
"хорошие" амфолиты должны располагаться вдоль градиента pH теснее, чем
амфоли-ты худшего качества. Особенно велика потребность в амфоли-тах с
низкими значениями s и изоточками в нейтральной области pH для
компенсации низкой электропроводности в зоне "фокусирования" воды. Для
успешного изоэлектрофокусирования желательно одновременное присутствие
как хороших, так и плохих амфолитов при повышенном содержании хороших
амфолитов в нейтральной области pH (Rilbe, 1976). Применение амфолитов с
высокими значениями Др К позволяет уменьшить число
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
39
амфолитов, необходимое для создания плавного градиента pH (Almgren,
1971). Однако если значение Др/( данного амфолита слишком велико, то для
получения необходимых буферной емкости и электропроводности придется
значительно повысить его концентрацию. В результате стационарное
состояние будет достигаться намного медленнее.
Можно ли рассчитать, какое число разных амфолитов требуется для
формирования плавного градиента pH? Проведение подобного расчета для
реальной системы может оказаться невыполнимой задачей. Тем не менее с
помощью ЭВМ удалось смоделировать и рассчитать упрощенную систему ИЭФ
(Almgren, 1971). Модельная система включала гипотетический набор
простейших амфолитов с одинаковой подвижностью и одинаковыми значениями
коэффициента диффузии и Др/С Считали, что все индивидуальные амфолиты
присутствуют в равных количествах и что их изоточки равномерно
распределены по всему диапазону pH. Результаты расчетов представлены
графически на рис.
1.9. А, ? и В. Для решения задачи надо задать параметры Др/ и Ар/С (в
единицах pH), а также ширину кривой распределения в стационарном
состоянии. Как видно из рис. 1.9, Л, система, состоящая из восьми
амфолитов со значениями Др/С=2 для каждого компонента и одинаковыми
инкрементами Др/ = 0,05, формирует плавный градиент в диапазоне pH от 7,0
до 7,25. Электропроводность (Я) в этом диапазоне постоянна. Таким
образом, можно считать, что для образования плавного градиента на единицу
pH должно приходиться не менее 30 разных амфолитов-носителей. Следует
отметить, что кривые распределения в этом примере очень широкие - любая
зона пересекается с четырьмя соседними (по две с каждой стороны) зонами
сфокусированных амфолитов. Для того чтобы "хорошие" амфолиты при ИЭФ
могли давать достаточно широкие зоны, следует или повышать их исходную
концентрацию (на рис. 1.9, А концентрация в пике составляет 10 мМ), или
понижать рабочее напряжение в колонке. Можно варьировать и оба этих
параметра одновременно.
В аналогичной системе для амфолитов с Др/С = 2, но с Др/ = 0,1 на единицу
pH приходится только 15 разных компонентов (рис. 1.9, ?).
Электропроводность в такой системе постоянна, но pH изменяется
ступенчато. Ступеньки (точнее, плато) располагаются в центральной части
каждой зоны. В области перехода между зонами амфолитов находятся участки
линейного роста pH. Превращение плавного градиента в ступенчатый связано
не столько с уменьшением (вдвое) числа амфолитов на единицу pH, сколько
со сжатием кривых статистического распределения для каждого компонента
примерно в 3 раза по срав- ' нению с кривыми на рис. 1.9, Л. В результате
зона любого ам-
40
Глава 1
фолита пересекается только с одной соседней зоной с каждой стороны. При
этом концентрация данного амфолита в центре соседней зоны падает до нуля.
Поскольку в этом примере значение Др/С амфолитов такое же, что и в
предыдущем, то образование более узких зон вызвано снижением концентрации
амфолитов (на рис. 1.9,5 значение в пике - 6 мМ) или повышенным
напряжением в системе.
Рис. 1.9. Моделирование с помощью ЭВМ процесса фокусирования в системе
