Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
"застревающие" в порах матрицы геля. Данная модель предполагает не
планарную (изображенную на рисунке), а пространственную упаковку
полипептидных цепей. Агрегаты могут быть стабилизированы и благодаря
стэкинг-взаимодействию между ароматическими кольцами различных остатков
красителя, которые достаточно жестко фиксируются посредством ионных
связей между двумя сульфогруп-пами каждой молекулы красителя и
аминогруппами пептидных цепей. (Righetti,
Chillemi, 1978.)
332
Глава 5
группы), что и приводит к образованию поперечных сшивок, агрегации и
иммобилизации объемистых агрегатов в геле (условное обозначение красителя
по Diezel et al., 1972).
Несмотря на то что вышеописанный метод позволяет сделать существенный шаг
вперед в области пептидного анализа, его, к сожалению, не удается
применить для детектирования представителей целого класса олигопептидов
(от ди- до тетрадекапептидов), среди которых, как известно, есть немало
биологически активных веществ. Отчасти этот пробел удается заполнить
(Gianazza et al., 1979b) благодаря использованию ультратонких гелей,
описанных в работе Gorg et al., 1978. Олигопептиды фокусируют в слое ПААГ
толщиной 300 мкм при высоком напряжении, позволяющем получить довольно
узкие зоны. После ИЭФ гель накладывают на лист фильтровальной бумаги и
немедленно высушивают в термостатируемом шкафу при 110°С. Гель высыхает
на бумаге в виде тончайшей пленки, которую можно опрыскивать любыми
специфическими реагентами на остатки Arg, Met, Cys, Туг, Тгр или His,
точно так же, как это делается при проявлении бумажных хроматограмм. Этим
способом можно регистрировать в среднем около 30% всех аминокислотных
остатков в олигопептидах, что позволяет достичь чувствительности на
уровне нескольких микрограмм на сфокусированную пептидную зону.
Независимо была предложена методика обнаружения сфокусированных пептидов
по окрашиванию остатков His, но не в высушенном, а во влажном геле
(Faupel, Von Arx, 1978). Есть основания полагать, что, используя
вышеупомянутые методические подходы, можно получить полную пептидную
карту, основываясь только на одномерном ИЭФ, что означает существенную
экономию времени и материалов по сравнению с традиционным двумерным
методом отпечатков пальцев (Gianazza, Righetti, 1979; Righetti et al.,
1980c).
В качестве одного из последних достижений следует отметить предложенную
недавно универсальную методику окрашивания зон, не зависящую от длины
пептидной цепи. После ИЭФ* высушенный ультратонкий гель обрабатывают
парами иода в закрытом сосуде. Молекулы иода быстро адсорбируются амфо-
литами-носителями, создавая по всей поверхности геля, высушенного на
бумаге, ровный коричневый фон. Сфокусированные' пептиды по не вполне
понятным причинам вызывают локальное ингибирование адсорбции иода и таким
образом могут быть обнаружены в варианте негативного контрастирования -
белые зоны на коричневом фоне. Поскольку прокрашивание не связано с
какими-либо химическими превращениями, оно оказывается полностью
обратимым. В то же время окраска может быть восстановлена при повторной
обработке парами иода в течение нескольких минут. Для получения ровного,
а не крапчатого ко-
Некоторые применения метода ИЭФ
333
ричневого фона содержание амфолинов в геле при ИЭФ повышают до 4% (против
обычных 2%), с тем чтобы сгладить просветы между сфокусированными зонами
индивидуальных амфолитов-носителей. Серьезным недостатком этого метода
является его низкая чувствительность - содержание пептидов должно
составлять не менее 30 мкг на зону. В то же время его удобно использовать
в сочетании с полупрепаративным ИЭФ пептидов, которые удается затем
элюировать из геля 80%-ной уксусной кислотой с выходом до 85% (рис. 5.3).
Помимо рассмотренных выше способов делались попытки окрашивать
сфокусированные пептиды обычным кислотно-спиртовым раствором кумасси
после предварительной обработки 5%-ным формальдегидом (Stock et al.,
1980). Однако такой метод едва ли можно считать удачным, поскольку он
приводит к фиксации и окрашиванию как пептидов, так и амфолитов-
носителей. В настоящее время ИЭФ стало весьма распространенным методом
изучения пептидов, особенно при исследовании пептидных гормонов (Noble et
al., 1977; Biscoglio De Jimenez Bonino et al., 1981; Schwartz et al.,
1981; Kohnert et al., 1973).
Несмотря на успехи в области аналитического ИЭФ пептидов, осуществление
фракционирования в препаративном варианте остается непростой задачей. Это
обусловлено главным образом близостью амфолитов-носителей и пептидов как
по мол. массе, так и по заряду. Данное обстоятельство крайне осложняет
процесс разделения пептидов и амфолитов после ИЭФ с помощью гель-
фильтрации, диализа или ионообменной хромаю-
33-44
+
Рис. 5.3. ИЭФ фрагмента последовательности 33-44 гормона роста человека
(hGH) в пластине ПААГ (150 мкг белка на зону). Зоны проявляли с помощью
кратковременной (несколько секунд) обработки геля парами иода. После
