Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
Некоторые применения метода ИЭФ
329"
пептидов не удавалось из-за их близкого сходства с амфолита-ми-носителями
по структуре и реакционной способности. Классические методы обнаружения
пептидов (окрашивание нингид-рином, обработка реактивом Фолина,
микробиуретовая реакция, окисление перманганатом, иод-крахмальная
реакция) на самом деле с тем же успехом могут быть использованы для
детектирования сфокусированных амфолинов в геле. О первых попытках
аналитического фокусирования пептидов сообщалось еще в 1973 г. (Kopwillem
et al., 1973). С помощью ИЭФ в геле авторы анализировали активные
фрагменты гормона роста человека, синтезированные твердофазным методом по
Merrifield, 1969. Детектирование сфокусированных зон было основано на
присутствии хромофора (динитрофенил-His) в полипептидных цепях. Ясно, что
такой способ детектирования не может быть универсальным. В случае плохо
растворимых в воде амфотерных антибиотиков ИЭФ проводилось в гелях,
содержащих 50% ДМСО (Righetti, Righetti, 1974). После ИЭФ гель погружали
в дистиллированную воду. При этом происходило быстрое вымывание ДМСО из
геля и вслед за тем преципитация сфокусированных компонентов с
образованием опалесцирующих зон, содержащих полностью активный материал,
количественное определение которого достигалось сканированием при 600 нм.
Конечно же, и этот метод может найти только ограниченное применение.
Переломным моментом в развитии метода можно считать 1978 г., когда были
опубликованы работы Righetti, Chillemi, 1978, и Bibring, Baxandall, 1978,
в которых независимо описывалось изоэлектрическое фракционирование
пептидов в сочетании с регистрацией зон обычными методами белкового
окрашивания. Как правило, использовался коллоидный раствор СВВ G-250 (или
R-250) в 12-15%-ной ТХУ. Краситель в мицеллах находится в лейкоформе
(прозрачный коллоидный раствор СВВ G-250 имеет бледно-зеленую окраску) и
только после связывания с пептидом (или белком) приобретает голубой цвет.
После фокусирования гель погружают непосредственно в раствор красителя.
Амфолиты-носители выходят из геля, а пептиды, малорастворимые в 12-15%-
ной ТХУ, дополнительно фиксируются за счет связывания молекул красителя,
которые могут образовывать поперечные сшивки между цепями. Таким образом;
по-видимому, формируются высокомолекулярные агрегаты, "застревающие" в
полимерной пространственной сетке геля. При этом сама матрица остается
неокрашенной, возможно, из-за того, что мицеллы красителя не способны
проникнуть во внутреннее пространство геля. Поэтому отпадает
необходимость в процедуре отмывания фона кислотно-спиртовым раствором
(что могло бы вызвать, в частности, удаление:
330
Глава 5
1Рис. 5.1. ИЭФ пептидов, содержащих от 8 до 54 аминокислотных остатков,
.проводили в слое 7%-ного акриламидного геля толщиной 0,7 мм, содержащем
2%-ные амфолины pH 3,5-10 и 8 М мочевину. Образцы (10-15 мкл с
концентрацией 10 мг/мл) наносили в виде смоченных соответствующими
растворами кусочков фильтровальной бумаги вблизи анода после
префокусирова-ния в течение 1 ч. Полное время фокусирования - 4 ч при
мощности 10 Вт (в равновесии напряжение составляло 1000 В). Гель
окрашивали коллоидным раствором СВВ G-250 в 12,5%-ной ТХУ. Образцы
представляли собой следующие синтезированные фрагменты последовательности
гормона роста человека: а - остатки с 31 по 44; б - с 15 по 36; в - со
111 по 134; г - с 1 по 24; щ - со 166 по 191; е -с 25 по 51; ж - со 157
по 191; з - с 1 по 36; и - с 96 по 134; к - со 115 по 156 и л - со 103 по
156. Более короткие фрагменты (окта-, нона-, дека- и додекапептиды) в
этих условиях не фиксировались и не окрашивались. (Righetti, Chillemi,
1978.)
^связанного с пептидами красителя и солюбилизацию материала фиксированных
пептидных зон). Данный метод позволяет зафиксировать и окрасить пептиды с
минимальной длиной около 12-14 аминокислотных остатков, т. е. с Mv около
1500 (см. рис.
5.1). Адсорбции красителя способствует присутствие в структуре пептида
остатков основных аминокислот и относительно высокое содержание
гидрофобных остатков. Краситель может взаи-
Некоторые применения метода ИЭФ
331
модействовать как с основными группами, так и с (преимущественно
близлежащими) боковыми цепями гидрофобных аминокислотных остатков.
Возможный механизм фиксации пептидов на стадии окрашивания
проиллюстрирован на рис. 5.2. (Righetti, Chillemi, 1978). Предполагается,
что краситель связывается одновременно с двумя полипептидными цепями
(через сульфо-
Рис. 5.2. Гипотетическая модель связывания пептидов с красителем.
Пептиды, не содержащие основных аминокислотных остатков (вверху), могут
взаимодействовать с красителем только за счет N-концевых аминогрупп,
образуя крайне нестабильные димерные комплексы, легко диссоциирующие в
воде. В нижней части рисунка изображены пептидные цепи, имеющие
дополнительный центр связывания (е-аминогруппа лизина). В этом случае
образуются макромолекулярные агрегаты, нерастворимые в воде и
