Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
возможно, не образует их совсем. Фокусирование poly (His) тоже не
сопровождается комплексообразованием. Кроме того, известно, что гистоны
беспрепятственно проходят по всей длине геля и собираются на катодной
полоске, не проявляя при этом никаких признаков комплексообразования с
ам-фолинами.
Возможность появления рассмотренных выше артефактов была подкреплена
теоретическими расчетами в работах Сапп, Stimpson, 1977; Stimpson, Сапп,
1977, и Сапп et al., 1978. Впрочем, авторы рассматривали лишь бинарную
модель, т. е. расщепление одного пика на два за счет взаимодействия с
амфо-литами-носителями. Только продемонстрировав профиль ИЭФ гепарина,
включающий 21 зону, мне удалось убедить Канна в том, что для
макромолекул, склонных к комплексообразова-нию с амфолинами, скорее всего
должно наблюдаться "мульти-плетное" артефактное расщепление зон. Это
связано с тем, что в образовании комплексов будут обязательно участвовать
несколько компонентов смеси амфолитов-носителей, а не какой-то один
компонент с определенным значением pi. Впоследствии эта точка зрения была
принята (Сапп, 1979). Помимо рассмотренных выше случаев артефактной
гетерогенности следует упомянуть о существовании еще одной группы явлений
этого типа. Имеются серьезные указания на то, что при фокусировании
клеток животных амфолиты-носители активно связываются с поверхностью
клеток, вероятно, за счет взаимодействия между
Общие экспериментальные аспекты
327
протонированными аминогруппами основной цепи амфолитов и расположенными
на поверхности остатками сиаловой кислоты (McGuire et al., 1980). Это
явление будет более подробно рассмотрено в следующей главе (см. рис.
5.6).
За исключением отмеченных случаев возникновения артефактов, связанных с
особенностями структуры некоторых классов макромолекул, практически нет
данных, которые свидетельствовали бы о том, что подобное расщепление
пиков может происходить в результате взаимодействия между амфолитами и
белками. Даже выдвинутое на первых порах утверждение об образовании
комплекса между амфолинами и фракцией кислых белков с низким содержанием
серы (Frater, 1970) было в дальнейшем опровергнуто в работе Marshall,
Blagrove, 1979, в которой было проведено вполне успешное изоэлектрическое
фракционирование этих же белков. Пожалуй, единственный достоверный случай
артефактного расщепления при ИЭФ белков был описан в работе Jonsson et
al., 1978. Было установлено, что фос-фопротеин из передних зубов крысы
связывается с амфолинами и фокусируется в виде набора зон с кажущимися
значениями pi в диапазоне pH 2,5-3,1, в то время как истинное значение
его pi составляет 1,1. Само по себе это не столь неожиданно, поскольку по
плотности отрицательного заряда такой кислый белок приближается к
гепарину и соответственно ведет себя подобно полианиону. Не исключено,
что аналогичным образом ведет себя и липопротеинлипаза (Bengtsson,
Olivecrona, 1977). Тем не менее экспериментатору следует смириться с тем,
что в подавляющем большинстве случаев гетерогенность, выявляемая с
помощью ИЭФ, непосредственно отражает реальное состояние самого белкового
препарата.
ГЛАВА 5
Некоторые применения метода ИЭФ
Опубликовано уже более 4000 работ, в которых описывается применение ИЭФ
для решения целого ряда задач в области биологии, биохимии и генетики.
Если вы рассчитываете найти здесь исчерпывающий обзор всех этих работ, то
смею вас заверить - или вам попалась не та книга, или мне попался не тог
читатель, или и то и другое вместе (впрочем, справедливости ради, не
следует упускать из виду и еще одну возможность - книге не повезло с
автором). В разд. 1.4. я перечислил основные книги и обзоры по ИЭФ,
которые читателю, вероятно, придется просмотреть для того, чтобы отыскать
сведения по интересующей его области применения метода. В настоящей главе
вкратце будут рассмотрены лишь отдельные примеры приложения ИЭФ,
свидетельствующие о том, сколь значительных успехов в изучении
биохимических процессов удается достичь сегодня, грамотно используя
широкие возможности этого метода. Некоторые из рассматриваемых примеров
были выбраны для того, чтобы продемонстрировать, с какими подводными
камнями и непреодолимыми препятствиями приходится сталкиваться при
неправильной постановке задачи, связанной с использованием ИЭФ.
5.1. ИЭФ пептидов
Возможность использования ИЭФ для разделения пептидов особенно
привлекательна ввиду свойственных этому методу высокой разрешающей
способности и эффекта изоэлектрического концентрирования сфокусированных
компонентов. Последнее обстоятельство весьма существенно для анализа
сложных смесей пептидов - природных, синтетических или полученных в
результате фрагментации крупных полипептидных цепей, поскольку пептиды в
отличие от белков характеризуются достаточно высокими коэффициентами
диффузии и при использовании традиционных методов фракционирования
образуют, как правило, диффузные зоны. Однако наладить аналитическое ИЭФ
