Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
полученные этим методом результаты основаны на артефактном -
фракционировании. К счастью, на сегодняшний день этот "кризис доверия"
удалось в основном преодолеть. Микрогетерогенность можно объяснить целым
рядом причин: (а) существованием кон-
формеров; разные компоненты могут представлять собой несколько
альтернативных устойчивых конформационных состояний одного и того же
вещества; (б) наличием нескольких олигомерных комбинаций между различными
субъединицами; <(в) неравномерным распределением углеводных остатков
между молекулами данного белка (в случае гликопротеинов);
(г) различиями в степени фосфорилирования, метилирования или
ацетилирования белков (часто имеет место в случае -ядерных белков); (д)
влиянием ограниченного протеолиза, особенно в процессе выделения белка;
(е) частичным дезаминированием остатков аспарагина и глутамина; (ж)
наличием прочно связанных с белком кофакторов или ингибиторов;
микрогетерогенность в этом случае может дополнительно возрастать из-за
вариаций заряда указанных лигандов, обусловленных, в частности,
окислительно-восстановительными процессами.
Различные варианты возникновения гетерогенности по заряду рассматриваются
в обзорах Epstein, Schechter, 1968; Kaplan, 1968; Williamson et al.,
1973, и Righetti, Drysdale, 1976. Имеются сообщения о том, что в
некоторых случаях наблюдаемая гетерогенность, по-видимому, является
артефактом и обусловлена 'особенностями самого метода ИЭФ (см. разд.
4.7), однако ни в одном из этих случаев строгих доказательств такому
утверждению не получено. Нам удалось обнаружить некоторые особые классы
веществ, ИЭФ которых и в самом деле сопровождается появлением артефактной
гетерогенности. Однако первичная структура и пространственная
конфигурация этих веществ не имеют ничего общего с теми типами структуры,
которые свойственны всем известным белкам. Далее мы рассмотрим такие
•особые случаи и для каждого из них дадим интерпретацию соответствующих
явлений, лежащих в основе возникновения микрогетерогенности при ИЭФ.
1. ИЭФ нуклеиновых кислот. Первое сообщение о фракционировании тРНК
методом ИЭФ появилось в публикации Righetti, Drysdale, 1972. За ним
последовал еще ряд работ, посвященных йзоэлектрическому фракционированию
а- и р-глобиновых мРНК, а также рибосомных 18S- и 28S-PHK из
ретикулоцитов кролика (Shafritz, Drysdale, 1975; Drysdale, 1977). Сам
факт разделения этих компонентов с помощью ИЭФ с точки зрения
Общие экспериментальные аспекты
321
теории является несколько неожиданным. Поскольку метод ИЭФ основан на
разделении только по заряду, то он, вообще говоря, должен быть
индифферентен к полидисперсности по молекулярной массе при условии
постоянства отношения заряда к массе. Более того, расчетное истинное
значение pi для тРНК (и, возможно, для большинства других нуклеиновых
кислот) составляет около 2,6 (Morris, 1978). В то же время оказалось, что
"кажущиеся значения р1" (р1Каж) для всех исследованных РНК находятся ц
диапазоне pH 3,5-5,2. Внимательный анализ опубликованных данных выявляет
следующее:
(а) в случае ИЭФ тРНК число и относительное распределение сфокусированных
зон зависят от способа внесения образца и от количественного соотношения
тРНК: амфолины;
(б) картина распределения зон тРНК при ИЭФ существенно изменяется в
присутствии 6М мочевины (резко уменьшается число зон и заметно снижаются
значения р1каж);
(в) при выделении индивидуальных фракций сфокусированной тРНК и повторном
их фокусировании вновь обнаруживалась микрогетерогенность, хотя и
выраженная в меньшей степени, чем при первом фракционировании;
(г) рибосомные РНК "фокусируются" в зонах, соответствующих pi каж 4,8
(для 18S) и 5,2 (для 28S), однако характер миграции этих РНК от катода
(область внесения образца) к аноду скорее свидетельствует о
фракционировании "по размеру", а не "по заряду". И действительно, обе
зоны имеют характерные "хвосты" со стороны катода. Кроме того, в то время
как зоны 18S- и 28S-PHK только начинают мигрировать в геле, нанесенная
одновременно 4S-PHK уже успевает пройти значительную часть пути к аноду и
"фокусируется" при значении рКаж 4,0;
(д) аналогично а-глобиновая мРНК мигрирует несколько быстрее (р1Каж 4,7-
4,8), чем (5-глобиновая (р1Каж 5,1-5,2), которая, как известно, несколько
крупнее первой.
Таким образом, эти наблюдения определенно свидетельствуют о том, что так
называемое "изоэлектрическое" фракционирование нуклеиновых кислот
(Drysdale, 1977) по сути дела имеет неизоэлектрическую природу. В работе
Galante et al., 1976, из данных по изменению температур плавления тРНК в
присутствии амфолинов был сделан вывод, что в основе разделения
нуклеиновых кислот при ИЭФ лежит образование прочных комплексов между
ними и амфолитами-носителями, формирующими градиент pH. Прочность таких
комплексов сильно зависит от pH - они практически не образуются в
нейтральной области (pH 7,4), малоустойчивы при pH 5,4 и очень прочны при
pH 4,2 и ниже, т. е. в характерной области кажущегося "фокусирования" и
