Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
а. Волны со стороны анода: высокое содержание связанного ¦С02 в католите;
следует использовать свежий раствор и держать его в плотно закрытой
посуде. Проблему удается отчасти разрешить, вводя в состав геля
глутаминовую и (или) аспарагиновую кислоты (2-5мМ) или некоторое
количество амфолитов широкого диапазона pH (3-10).
б. Волнистость наблюдается в отдельных треках: слишком высокое содержание
соли в образцах. Волнистость в зоне нанесения образцов: кусочки
фильтровальной бумаги, использованные для нанесения образцов, следует
удалить с поверхности геля примерно через полчаса; лунки в геле заполнить
разбавленным раствором амфолитов.
Проблема: преципитация образца.
Причины и меры по устранению.
а. Четкие линии: изоэлектрическая преципитация. Можно •снизить загрузку
образцом, использовать крупнопористые гели. Взаимодействие с амфолитами-
носителями обнаружено только .для полианионов: можно использовать
дезагрегирующие агенты.
б. Преципитация в зоне нанесения: наличие высокомолекулярных компонентов.
Следует использовать или более крупнопористые полиакриламидные, или
агарозные, или гранулированные гели. При наличии водонерастворимых
компонентов вводят добавки (детергенты, мочевину, для некоторых
глобулинов- глицин). Неблагоприятное значение pH в зоне нанесения:
переместить зону нанесения к аноду или катоду. В первом опыте лучше
наносить образец в нескольких различных участках геля; таким образом
можно одновременно решить и вышеупомянутую .проблему, и подобрать условия
минимизации времени фокусирования. При работе с компонентами, склонными к
агрегации, следует ввести в гель детергенты или мочевину, если это
допустимо (для большинства белков допустимо присутствие по крайней мере
2М мочевины). Иногда полезно ввести в образец тиолсодержащие соединения,
а в тех случаях, когда возможно ион-парное взаимодействие с амфолитами, -
изменять место внесения образца.
Проблема: нестабильность градиента pH (катодный дрейф).
Причины и меры по устранению.
а. Наличие связанных с матрицей зарядов: избыток инициаторов
полимеризации, примеси акриловой кислоты. Перекристал-лизовать акриламид,
пропустить раствор акриламида через ионообменник, ввести в гель
дополнительные положительно заряженные группы (Righetti, Macelloni,
1982). Отчасти проблему удается решить, повышая вязкость среды с помощью
сахарозы, глицерина или мочевины (использование последней наи-
Общие экспериментальные аспекты
более эффективно, но не всегда допустимо). Можно также по-высить % Т и
расширить градиент в щелочную область. В этой ситуации очень важно
установить минимальное время фокусирования и не превышать его.
б. Отклонение профиля pH от ожидаемого может наблюдаться в тех
случаях, когда образец в значительном количестве содержит примеси
амфотерных электролитов, а также слабых кислот или оснований.
Проблема: аномальные явления на поверхности геля.
Причины и меры по устранению.
а. Жидкость на поверхности геля: неполная полимеризация. Полностью
удалить жидкость с помощью листка фильтровальной бумаги осторожными
движениями, избегая прилипания бумаги к гелю. /
б. Жидкость скапливается у катода: катодный дрейф (см. выше). Наложить
полоску фильтровальной бумаги шириной-
2-3 см, свободно свисающую с внешней стороны геля и на!
3-4 мм заходящую на катодную полоску.
в. Кусочки фильтровальной бумаги, использованные для внесения образцов,
прилипли к поверхности геля. Следует смочить их избыточным количеством
воды, подождать несколько-секунд, удалить вместе с избытком воды.
г. Появление кристаллов мочевины: слишком интенсивное охлаждение при
фокусировании или при хранении (для 8М мочевины температура должна быть
не ниже 10 °С) или пересыхание геля. В последнем случае следует уменьшить
доступный^ объем свободного пространства вокруг геля - поверх электродов
можно положить стеклянную пластину, по бокам под пластину подложить
увлажненные прокладки из фильтровальной бумаги. Отдельные кристаллики
мочевины можно растворить в. нескольких каплях воды. В действительности
влияние кристаллизации мочевины, как правило, далеко не так опасно, как
может показаться на первый взгляд.
д. Вспенивание у электродов в присутствии детергентов обусловлено
переносом воды (дрейф градиента) и выделением пузырьков Н2 и 02 (продукты
электролиза). Для предотвращения-короткого замыкания скопившуюся жидкость
необходимо удалить (см. выше). Следует воспользоваться двойными
положенными друг на друга электродными полосками.
4.11. Артефакты. Общий анализ
С повсеместным внедрением метода ИЭФ стало ясно, что-микрогетерогенность
белков - это чрезвычайно распространенное явление, причины и
физиологическое значение которого -окончательно не установлены. Напротив,
об абсолютно гомо-
320
Глава 4
-генном белковом препарате теперь можно говорить только как о несбыточной
мечте. В начале семидесятых годов целый ряд биохимических журналов
отказывался принимать статьи, связанные с использованием ИЭФ, считая, что
