Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 117

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 111 112 113 114 115 116 < 117 > 118 119 120 121 122 123 .. 171 >> Следующая

ж. Определение Ка из кривых титрования. Одно из последних приложений
метода получения кривых зависимости подвижности от pH - определение
констант диссоциации (Кй) комплексов типа белок-лиганд и исследование их
рН-зависимости. Для этого используется ряд методических приемов,
разработанных в свое время для аффинного электрофореза (Horejsi, 1979).
Рис. 3.43. Картина обычного равновесного ИЭФ (вверху) и кривые титрования
(внизу) карбоангидразы из эритроцитов быка в диапазоне pH 3,5-9,5. -
Условия получения кривых титрования: 1-е направление-10 Вт, 50 мин; 2-е
направление - 700 В, 15 мин. Стрелка указывает на кривую титрования
^одного из изоферментов, которая в щелочной области имеет очень пологую
форму. При внесении образца в гель (при обычном ИЭФ) со стороны катода
этот компонент образует диффузную зону (см. стрелки у двух верхних треков
<на профиле обычного ИЭФ). В то же время при внесении образца в область
ФН ниже значения pi этого компонента он фокусируется в виде узкой зоны .
(см. стрелки у двух нижних треков на профиле обычного ИЭФ). Двойные
^стрелки со значками "+" и " в левом нижнем углу показывают направление и
полярность электродов на стадиях ИЭФ и ЭФ (Ек, 1981.)
280
Глава 3
Высокомолекулярный лиганд просто включают в состав геля, а
иизкомолекулярный ковалентно "пришивают" к матрице. При возрастании
концентрации лиганда в геле наблюдается постепенное pH-зависимое
"запаздывание" кривой титрования. Построив график зависимости снижения
подвижности белка от концентрации лиганда в геле, можно рассчитать
значение Ка при любом фиксированном pH. Этот метод был разработан при
изучении связывания гликогена с фосфорилазами а и Ь, голубого декстрана с
некоторыми дегидрогеназами и сахаров с лектина-ми (Ek et al., 1980; Ек,
Righetti, 1980). В качестве примера на рис. 3.41 приведены такие кривые
"аффинного титрования", отражающие связывание лектинов из семян Ricinus
communis с аллил-а-О-галактозой, которая была включена в состав геля
путем сополимеризации с акриламидом. Можно определить значение Ка при
любом pH (обычно при шести разных значениях pH от 4 до 9), а затем
построить график зависимости Ка от pH (рис. 3.42).
В заключение отметим, что метод кривых титрования может предоставить
очень широкие возможности для изучения некоторых физико-химическйх
параметров белков, а также динамических аспектов их взаимодействия с
лигандами. С тем, как практически получают кривые электрофоретического
титрования белков, можно познакомиться в работах ~Ек, 1981, и Righetti,
Gianazza, 1981. Интересный пример применения метода проиллюстрирован на
рис. 3.43. Давно было известно, что некоторые белки при их внесении в
гель поблизости от анода фокусируются в виде очень узких зон, а при
внесении у катода - в виде диффузных зон (или наоборот). Объяснить это
явление в общем случае не удавалось; предполагали, что оно может
порождаться взаимодействием белков с амфолитами-носителями определенного
диапазона. -На самом деле его легко объяснить при рассмотрении рис. 3.43,
на котором представлены кривые титрования форм карбоангидразы из
эритроцитов быка, а в верхней части - картины равновесного ИЭФ. Многие
изоферменты характеризуются достаточно крутыми кривыми зависимости
подвижности от pH вблизи pi и поэтому при обычном ИЭФ фокусируются в виде
узких зон независимо от места нанесения образца (у катода или у анода). В
то же время для двух наиболее основных изоферментов кривые титрования
имеют очень пологую форму при pH выше pi и более крутую - при pH ниже pi.
Соответственно оба изофермента, будучи внесены со стороны анода, быстро
фокусируются в равновесные узкие зоны. При внесении со стороны катода они
образуют диффузные зоны, удаленные от области истинных значений pi,
поскольку скорость миграции этих компонентов к равновесному положению
значительно меньше, чем у других изоферментов.
ГЛАВА 4
Общие
экспериментальные аспекты
4.1. Изоэлектрическая преципитация
Одним из основных недостатков ИЭФ в жидкой среде является преципитация
некоторых относительно малорастворимых белков в изоточке. При выпадении
осадка образовавшиеся первоначально небольшие частицы слипаются и
хлопьями постепенно оседают вниз по всей длине колонки. Поэтому картина
разделения часто оказывается испорченной из-за налипания осадка на
стенках колонки, искажения градиента плотности и загрязнения соседних
белковых зон. Иногда преципитация и выход белка из зоны его pi
сопровождается растворением белка, который после этого мигрирует обратно,
к прежнему положению, где снова начинает выпадать в осадок. Так может
возникнуть некое квазиравновесное состояние, при котором белок
присутствует в различных "агрегатных состояниях" на .достаточно
протяженном участке градиента pH. Во многих случаях преципитации удается
избежать, понижая загрузку белка или повышая рабочую концентрацию
амфолитов-носителей. В обоих случаях недостатком такого решения является
неэкономичное соотношение белок: амфолины, поэтому лучше использовать
Предыдущая << 1 .. 111 112 113 114 115 116 < 117 > 118 119 120 121 122 123 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed