Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 116

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 110 111 112 113 114 115 < 116 > 117 118 119 120 121 122 .. 171 >> Следующая

подвижность оказывают только доступные для растворителя поверхностные
функциональные группы, не вовлеченные в межсубъединичные и другие
взаимодействия. Поэтому была разработана методика электрофоретического
титрования в денатурирующих условиях, например в присутствии 8М мочевины
(Righetti et al., 1979а). В этих условиях многие белки существуют в виде
хаотических клубков, происходит разрушение субъединичной структуры и
диссоциация нековалентно связанных лигандов и кофакторов, а ранее
экранированные заряженные группы белка оказываются доступными для
растворителя. Сравнение кривых электрофоретического титрования не
связанных с гемом а- и р-глобиновых цепей в 8М мочевине позволяет "с
высоты птичьего полета" увидеть характерные особенности аминокислотного
состава этих двух по-липептидных цепей. Так, ввиду того что основные
различия между а- и p-цепями касаются относительного содержания дикар-
боновых аминокислот, их кривые титрования заметно сближаются лишь при pH
ниже 3, т. е. в такой области, где различия в подвижности могли бы быть
связаны только с различиями в наборе основных аминокислот. Наблюдаются и
некоторые отклонения от идеальности, проявляющиеся, в частности, в том,
что при pH около 3 кривые полностью сливаются (чего быть не должно), а
также в том, что каждая из двух кривых разветвляется при pH несколько
выше и несколько ниже pi, вероятно в результате частичной
изоэлектрической агрегации и преципитации белков. В то же время
проведение процесса при совместном присутствии 8М мочевины и 1%-ного NP-
40 позволяет избежать указанных артефактов. Это, по-видимому, объясняется
тем, что связывание детергента с гидрофобными участками по-липептидных
цепей предотвращает межмолекулярные взаимодействия, которые в отсутствие
детергента приводят к преципи-
Аналитическое ИЭФ
277
тании белков вблизи изоточки (Righetti, Gianazza, 1979b, 1980).
д. Кривые титрования в крупнопористых матрицах. В работе Bianchi
Bosisio et al., 1980, были исследованы возможности проведения
электрофоретического титрования в крупнопористых гелях (ПААГ, содержащий
15-50% "сшивки" - бис или ДАТД), при использовании которых можно
рассчитывать на практически беспрепятственную электрофоретическую
миграцию белков со значениями Мг в диапазоне нескольких миллионов. К
сожалению, при работе с ДАТД образуются липкие и непрочные гели, которые
содержат до 80-90% незаполимеризо-равшегося ДАТД, способного вступать в
реакцию с белками. С другой стороны, гели с СбИс=(40-50)% оказываются
слишком гидрофобными, им свойственны деформация матрицы и отторжение
воды. Приемлемым компромиссом можно считать гели
Рис. 3.41. Кривые аффинного титрования лектинов из семян Ricinus
communis. Состав геля: 6% 7, 4% Сбнс 2% амфолинов pH 3,5-10 и по 2 мМ
Glu, Asp, Lys и Arg. Содержание лиганда (аллил-a-D-галактозы),
использованного в качестве сополимеризующегося компонента в процессе
приготовления геля: а -контроль, лиганд отсутствует; б-10 мкМ; в -40 мкМ;
г -50 мкМ; д - 70 мкМ; е- 100 мкМ. Во всех случаях в гель вносили 200 мкг
белка в объеме 100 мкл. Разделение в первом направлении проводили в
течение 80 мин при постоянной мощности 10 Вт, во втором направлении--20
мин при постоянном напряжении 700 В. В обоих случаях в качестве католита
использовали 1 М NaOR, в качестве анолита - IM Н3Р04. Гель
термостатировали при 4°С в термостате типа Lauda KR4. Отметки на (а) и
(г) указывают положение зоны внесения образца (зоны нулевой подвижности),
двойные стрелки со значками -с-f" и " -"- полярность электродов и
направление на стадиях ИЭФ и ЭФ.
(Ek et al, 1980.)
278
Глава 3
pH
Рис. 3.42. Зависимость константы диссоциации комплекса (Кл) для лектинов
Ricinus communis (О) и Lens culinaris (•) от pH. Использованные значения
Кл рассчитаны на основе данных по изменению электрофоретической
подвижности при различных pH из кривых аффинного титрования, подобных
тем, что показаны на рис. 3.41. Стрелки указывают значения pi для каждого
из лектинов. (Ek et al., 1980.)
с Сбис = 30%, достаточно стабильные и вместе с тем не оказывающие
заметного сопротивления миграции белков с Мг до 0,5-106.
е. Непосредственное определение рК на основании кривых титрования.
Разработана математическая теория, позволяющая рассчитать р/С
ионизующихся групп непосредственно из профиля зависимости подвижности от
pH (Righetti et al., 1979с; Valentini et al., 1980). Были выведены
соответствующие уравнения, связывающие электрофоретическую подвижность со
степенью ионизации катионов, анионов или простейших амфолитов. В случае
неамфотерных -ионов для определения значений р/Сс или р/Са достаточно
только определить значение pH (pHi/2), соответствующее половинной (по
отношению к максимальной) подвижности к катоду или аноду соответственно.
Для амфотерных молекул значение pHi/2 необходимо скорректировать с учетом
влияния степени ионизации по второму заряду противоположного знака на
подвижность рассматриваемого типа ("анодную" или "катодную").
Предыдущая << 1 .. 110 111 112 113 114 115 < 116 > 117 118 119 120 121 122 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed