Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
Это весьма существенный момент, так как при проведении электрофореза во
втором направлении на этих участках из-за присутствия 1 М кислоты и 1 М
щелочи выделялось бы слишком много тепла. Новые электроды накладывают
перпендикулярно положению электродов первого направления и заполняют
желобок раствором анализируемого образца (рис. 3.39,В). После этого
проводят электрофорез в направлении, перпендикулярном стационарному
градиенту pH, обычно при напряжении около 600 В/12,5 см в течение 10-45
мин (рис. 3.39,/). Приведем некоторые примеры применения этого метода.
а. Генетические варианты. При фракционировании смеси нормального и
мутантного белков можно получить "дифференциальную" кривую титрования и с
ее помощью установить, аминокислотная замена какого типа привела к
появлению мутантного фенотипа (рис. 3.40). Например, при замене остатка
Lys две кривые могут слиться только при pH около 11, а при замене остатка
Giu или Asp точка слияния кривых должна находиться около pH 3. Можно
также зарегистрировать мутации с изменением знака заряда (например, Lys-
>K31u) или с его сохранением (например, Arg-*His). Кривые титрования типа
теоретических кривых, приведенных на рис. 3.40, удавалось наблюдать
экспериментально при фракционировании смесей нормального гёмоглобина
взрослого человека НЬА с такими мутантными формами, как HbS, HbC, Hb
Suresnes и HbG Philadelphia (Righetti et al., 1978; Righetti, Gianazza,
1979).
б. Взаимодействие белок-лиганд. В работе Krishnamoorthy et al., 1978,
были исследованы кривые титрования комплексов метгемоглобин-
инозитгексасульфат (ИГС) и метгемоглобин- инозитгексафосфат (ИГФ). Было
показано, что комплекс с ИГС стабилен в диапазоне pH 3,7-6,0, а комплекс
с ИГФ - при pH 4,5-6,0. Оба комплекса характеризуются значениями
константы диссоциации Kd порядка микромолей и в условиях эксперимента
стабильны в течение 8-10 мин. При изучении комплекса с 2,3-
дифосфоглицератом (Kd которого, как известно, превышает миллимолярный
уровень) в диапазоне pH 3-10 наблюдалась только кривая титрования,
соответствующая свободному гемоглобину. Это указывает на то, что под
действием электрического поля данный комплекс очень быстро разруша-
\
Аналитическое ИЭФ
275
Рис. 3.40. Теоретические кривые титрования нормального гемоглобина и его
генетических вариантов, содержащих определенную аминокислотную замену.
НАК - нейтральная аминокислота. Штриховые прямые указывают зону нулевой
подвижности (внесение образца). (Righetti, Gianazza, 1979.)
ется. Очень неустойчивые интермедиаты, вероятно, можно зарегистрировать,
проводя опыты при температуре от -15 до . - 20°С, как это описано в
работах Perrella et al., 1978, 1979. С помощью рассматриваемого метода
двумерного фракционирования удалось продемонстрировать связывание
витамина D3 и его производных с витамин D-связывающим белком из сыворотки
крови человека (Ccxnstans et al., 1980). Показано, что связывание лиганда
вызывает конформационные изменения в структуре апопротеина. Метод
позволяет исследовать стехиометрию комплексообразования, а также диапазон
pH стабильности комплекса.
в. Белок-белковые взаимодействия. Метод получения кривых титрования
был использован для изучения взаимодействия между цитохромом b$ (Cyt b5)
и метгемоглобином (met-Hb) (Righetti et al., 1978b). При фракционировании
в геле каждого из этих белков по отдельности наблюдается классическая
сигмоидная кривая титрования. В то же время при "титровании" смеси белков
происходило сильное размывание картины при pH выше pi для Cyt 65 и при pH
как выше, так и ниже pi для Met-Hb. Наиболее интенсивное взаимодействие
белков, судя по всему, происходит при pH 8,0-8,3, что согласуется с
представлением о доминирующей роли остатков лизина met-Hb в связывании с
карбоксильными группами боковых цепей аминокислотных остатков Cyt 65. В
дополнение к этой работе было исследовано взаимодействие NADH-Cyt 65
редуктазы и Cyt b5 с использованием прямой регистрации кривых титрования
фермента (Los-tanlen et al., 1980). Независимо об использовании методов
зи-мограмм и иммунологических реплик для прямой регистрации
18*
276 Глава 8
кривых титрования сообщалось в публикации Gianazza et al.,
1980. Исследовалось взаимодействие между гемоглобином и гаптоглобином
(Нр), а также между свободными а- и р-глоби-новыми цепями и Нр. Комплексы
типа Нр-НЬ устойчивы во всем диапазоне pH 3-10, и это указывает на то,
что главную роль в их образовании играют неионные взаимодействия. В то же
время свободные p-цепи, вероятно, не образуют прочного комплекса с Нр.
При совместном "титровании" a-цепей и Нр наблюдается весьма своеобразный
профиль рН-зависимости, указывающий на наличие взаимодействия смешанного
типа (неопубликованные данные, полученные совместно с R. Krishna-moorthy,
D. Labie и M. Waks).
г. Кривые титрования в присутствии 8М мочевины и детергентов. Изучение
зависимости подвижности нативных белков от pH не дает возможности
непосредственно выявить все ионизуемые группы белка. Влияние на
