Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 114

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 108 109 110 111 112 113 < 114 > 115 116 117 118 119 120 .. 171 >> Следующая

25, 62 и 68 a-цепи находится положительно заряженная группа (скорее всего
остаток лизина). Возрастание гидрофобности аминокислотных остатков в этих
положениях приводит к локальному понижению диэлектрической проницаемости
и соответственно к понижению эффективного значения р/СКаж основной
группы, вплоть до полного ее депротонирования в области рН = р1 в ряду
Hbi-Hb4 (Righetti, 1979). Тот факт, что в нативном тетрамере замена одной
нейтральной аминокислоты на другую сопровождается не очень большим, но
заметным изменением pi, сам по себе не вызывает большого удивления.
Однако нам удалось разделить мутантные формы с "нейтральной" точечной
заменой даже при ИЭФ полностью денатурированных глобиновых цепей, т. е. в
таких условиях, когда на значении рК не могут сказываться конформационные
переходы. Это удалось сделать в экспериментах по изоэлектрическому
разделению. "Р- и у-цепей глобина с целью диагностики талассемии
(Righetti et al., 1979; Comi et al., 1979; Saglio et al., 1979; Guerasio
et al., 1979). При ИЭФ в геле, содержащем 8М мочевину и 3%-ный NP-40,
зона, соответствующая у-цепи, расщепляется на две с pi 6,95, отвечающей G
-цепи (глицинсодержащей), и с pi 6,85, отвечающей А -цепи
(аланинсодержащей) (рис. 3.38). Эти цепи, отличающиеся друг от друга
только природой остатка в положении 136 (Gly или Ala), являются
продуктами двух неаллельных локу-
*72
Глава 3
сов, расположенных вблизи структурных генов а- и р-глобино-вых цепей. Для
объяснения различий в значениях pi, которые наблюдаются при ИЭФ пары
нейтральных мутантных форм в присутствии мочевины и неионного детергента,
т. е. в таких условиях, в которых белки обладают полностью
неупорядоченной структурой, была высказана следующая гипотеза (Righetti
et al., 1980). Предполагается, что мицеллы детергента преимущественно
взаимодействуют с Av-цепью, в частности с ее относительно более
гидрофобным участком Met133-Leu141. Это взаимодействие подавляет
протонироваНие остатка Lys132, что приводит к изменению заряда (потере
одного протона) в данном фенотипе. Мы предположили, что этот пептидный
сегмент Ач-цепи связывается со слоем Штерна в мицеллах детергента. В
качестве альтернативной модели можно допустить включение этого сегмента в
гидрофобное ядро мицеллы, подобно тому, как это наблюдалось в случае
гемина (Simplicio et al., 1975) или гидрофобных мембранных белков
(Hackenberg, Klingenberg, 1980). Ситуация с (Av-Gv)-цепями не
представляется уникальной. Аналогичное изменение заряда наблюдалось и для
гисто-нов. Если окажется, что нейтральные замены такого типа с тем же
успехом можно обнаруживать и для других белков, то с помощью ИЭФ удастся
зарегистрировать вдвое больше генетических вариантов, чем это было до сих
пор сделано на основе традиционных электрофоретических методов. По сути
дела, это положение уже получило подтверждение на практике (см.
3.3.6 и рис. 3.25).
Рис. 3.38. Разделение цепей глобинов человека с помощью ИЭФ в отсутствие
(Л) и в присутствий (Б) детергента NP-40. В треках 1,2,3 (л) и 2,3,4 (?)
- хроматографически чистые а-, (3- и у-цепи соответственно. В треках 4
(А) и 1 (В) - смесь глобиновых цепей. (Saglio et al., 1979.)
Аналитическое ИЭФ
27*
3.7. Кривые титрования
Для написания этой главы потребовалось столько усилий, что мне хотелось
как-нибудь особо отпраздновать ее завершение. Поэтому я и решил закончить
главу рассмотрением одного из вариантов метода двумерного
фракционирования, которое, вообще говоря, следовало бы включить в разд.
3.4. Первое сообщение о методе было сделано в 1976 г. на симпозиуме в
Гамбурге (Rosengren et al., 1977). Авторы использовали его в качестве, по
их выражению, "простого способа выбора оптимального pH для
электрофоретического фракционирования". В действительности метод
позволяет получить непосредственное изображение на пластине геля кривых
титрования всех белковых компонентов смеси.
На рис. 3.39 показана последовательность операций, осуществляемых в
процессе получения кривых зависимости подвижности от pH. Готовится
пластина ПААГ толщиной 2 мм с желобком
Рис. 3.39. Последовательность операций при получении кривых титрования
бел-ков с помощью электрофореза в поперечном градиенте pH. На первой
стадии формируется градиент pH с помощью фокусирования смеси амфолитов-
носителей (Л). Затем удаляют электродные полоски (5) и вносят раствор
образца в желобок, расположенный перпендикулярно направлению градиента pH
(В), Электрофорез проводят в направлении, перпендикулярном направлению
ИЭФ (Г). (Righetti, Gianazza, 1979.)
18-1488
374
Глава 3
образца. В настоящее время наборы для получения кривых титрования в 1,5-
мм гелях поставляются фирмами LKB Produkter АВ (№ 2117-801) и Bio Rad
Labs. Первая стадия заключается в ИЭФ смеси амфолитов-носителей, что
приводит к формированию стабильного градиента pH. На этой стадии образец
не вносится. По окончании ИЭФ электродные полоски вместе с расположенными
под ними полосками геля отрезают с помощью длинного ножа (рис. 3.39,5).
Предыдущая << 1 .. 108 109 110 111 112 113 < 114 > 115 116 117 118 119 120 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed