Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
(координата), М - подвижность, С - концентрация белка, Е - напряженность
поля, а2 - квадратичное отклонение, равное D/(dM/dx)E; (dM/dx) ~ =
(dAf/dpH) (dpH/dx); D -- коэффициент диффузии; dM/dx - скорость миграции,
(Catsimpoolas, 1975.)
программа для компьютерной обработки данных в методе предстационарного
ИЭФ. На рис, 3.36 указаны различные физико-химические параметры,
измеряемые с помощью этого метода (Catsimpoolas, 1975b). К сожалению, как
сетует сам автор, "...хотя кинетическая теория и современное оборудование
позволяют провести все интересующие нас измерений, необходимость введения
многочисленных поправок, связанных с отклонениями от идеальности, которые
возникают главным образом из-за несовершенства современных амфолитов,
делает метод малопригодным. Освоить новые сферы применения ИЭФ поможет
динамичное развитие новой методологии и аппаратуры, а также
совершенствование соответствующих разделов кинетической теории и
разработка столь необходимых методов синтеза амфолитов второго
поколения". Решающим шагом на пути к "заветной цели" окажется
использование иммобилизованных градиентов pH (см. разд. 1.11.7).
3.6. Обнаружение мутаций, приводящих к замене одной нейтральной
аминокислоты на другую
Подавляющее большинство мутаций, обнаруживаемых по изменению положения
белкового пятна на электрофореграмме,
270
Глава S
связано с заменой какой-либо аминокислоты, несущей заряженную боковую
группу. Например, для гемоглобинов человека на октябрь 1973 г. описаны
174 точечные мутации (Hunt, Dayhoff,
1974): 61 - в а-цепи, 99 - в р-цепи, 8 - в у-цепи и 6 - в 6-цепи. Из всех
них только 35 (т. е. около 20%) представляют собой замены нейтральной
аминокислоты на нейтральную (главным образом замена Pro^Leu, составляющая
около 30% всех мутаций такого типа), которые скорее всего были обнаружены
не электрофоретическими методами, а по функциональным изменениям и
локализованы с помощью химического анализа (обработка трипсином,
получение пептидной карты и аминокислотный анализ аномальных пептидов).
Обобщив эти данные и учтя среднестатистическую представленность
заряженных аминокислот в белке, можно подсчитать, что только около 40%
всех возможных мутаций сопровождается изменением заряда и соответственно
может быть обнаружено электрофоретическими методами. Это значит, что
остальные 60% мутаций будут в этом смысле "молчащими", т. е. их не
удастся непосредственно выявить электрофоретическими методами. Есть
некоторые основания считать, что с помощью ИЭФ можно обнаружить и эти,
"молчащие", мутации. Хорошим примером тому являются результаты,
полученные в опубликованной недавно статье Whitney III et al.,
1979. При изучении гемоглобинов мыши с помощью ИЭФ авторам удалось
зарегистрировать несколько нейтральных замен a-цепи. Были разрешены
следующие гаплотипические варианты, несущие мутации в трех положениях, -
а25, а62 и a68:Hbi(Gly25, Val62, Asn68); Hb2(Gly25, Val62, Ser68);
Hb3(Gly25, Val62, Thr68) и Hb4(Val25, lie62, Ser68). Значения
изоэлектрических точек при фокусировании нативных тетрамеров от Hbi к Hb4
последовательно убывают, а общая гидрофобность нарастает (рис. 3.37). По
моим оценкам, гидрофобность НЬ2 по сравнению с Hbi по шкале гидрофобности
из работы Nozaki, Tanford, 1971, изменяется на A/t=- 500, а для пары НЬ3-
НЬ2 Д/t =-800 (в случае НЬ4 подсчет общей гидрофобности осложнен из-за
отсутствия необходимого количества данных). Мне представляется, что
повышение общей гидрофобности a-цепи вызывает соответствующее понижение
pi тетрамера из-за уменьшения суммарного положительного заряда. Можно
думать, что это не просто единичный случай, а проявление некоторой более
общей закономерности. Так, в случае пероксидазы из хрена при связывании
простетической группы - протогема IX - с имидазоль-ной группой остатка
гистидина в белке (Mauk, Girotti, 1974) р/С этой группы уменьшается от
своего обычного значения (около 6) практически до нуля (Dunford,
Stillman, 1976). Найдено, что при инкубации протопорфирина IX
(содержащего четыре имида-зольные группы, две из которых протонируются со
значением р/С
Аналитическое ИЭФ
271
*
*
3
У
5
а
*
Q25y62N68
G25V62S68
G25V62T68
VZ5|62S68
в-
о
Рис. 3.37. Разделение мутантных гемоглобинов мыши, в которых произошли
замены одной нейтральной аминокислоты на другую. Слева направо:
представлены мутантные формы, содержащие остатки Gly25, Val62, Asn68;
Gly28, Val62, Ser68; Gly25, Val52, Thr58; Val26, lie62, Ser68. Обратите
внимание на корреляцию между возрастанием гидрофобности мутантной формы и
уменьшением pi. В основу положены данные ИЭФ из работы Witney et al.,
1979. (Righetti
et al., 1980.)
около 6,5) в растворе, содержащем мицеллы нейтрального детергента тритона
Х-100, наблюдается уменьшение р/С, примерно до 0,9 (Savitskii et al.,
1978). Я могу предположить, что в нативном гемоглобине мыши на расстоянии
нескольких ангстрем от боковых групп аминокислотных остатков в положениях
