Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 111

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 105 106 107 108 109 110 < 111 > 112 113 114 115 116 117 .. 171 >> Следующая

единицу. В геле второго направления продукты карбамилирования
стандартного белка будут выглядеть как цепочки пятен с практически
одинаковой молекулярной массой, расположен-
Аналитическое ИЭФ
265
ных на расстоянии около 0,1 ед. pH друг от друга. При карба-милировании
p-цепи гемоглобина человека образуется 12 таких пятен, соответствующих
ступенчатому карбамилированию одиннадцати остатков лизина и одной
концевой а-аминогруппы. Цепочка продуктов карбамилирования карбоангидразы
из эритроцитов быка насчитывает 20 звеньев, а креатинфосфокиназы из мышцы
кролика - 30.
В качестве стандартов для электрофореза в ДДС-Na можно использовать набор
ковалентносшитых олигомеров какого-либо белка с известным значением Mr
(Inouye, 1971). Однако такие олигомеры часто обнаруживают аномальное
поведение при электрофорезе в ДДС-Na. Поэтому в качестве внутреннего
стандарта на ДАЛЬТ-направлении было предложено использовать суммарный
белок из гомогената сердца крысы (Giometti et al.,
1980). При электрофорезе в ДДС-Na белки гомогената проявляются в виде 80
зон. При этом 12 основных зон располагаются по всей длине геля таким
образом, что различия между значениями Mr соседних компонентов составляют
от 300 (около трех аминокислот) до 10000 (около ста аминокислот -
преимущественно в верхней высокомолекулярной области геля). Этот гомо-
генат, экстрагированный раствором ДДС-Na и содержащий 0,7% агарозы, можно
разлить по пробиркам небольшими аликвотами и хранить при температуре от -
20 до -70 °С. При хранении в течение 12 мес такой препарат дает полностью
воспро-
Рис. 3.34. Вырезание полоски после ИЭФ в ультратонком геле. Ширина
полоски должна соответствовать ширине лунки в геле второго * направления.
(Gorg et al., 1981.)
Глава 3
Пластиковая
Перенесение полоски геля после ИЭФ на гель второго направления
(электрофорез)
Рис. 3.35. Осуществление контакта между гелями 1-го и 2-го направлений.
Полоску геля после ИЭФ споласкивают в воде, уравновешивают в буфере,
содержащем ДДС-Na, удаляют избыток жидкости с поверхности и переносят в
лунку, вырезанную в геле 2-го направления. Благодаря тому что гель
зафиксирован на полиэфирной пленке (которая при наложении полоски должна
оказаться сверху), операция перенесения полоски заметно облегчается.
Справа показан вертикальный разрез участка контакта гелей. Видно, что
лунка вырезается не на всю толщину геля 2-го направления. (Gorg et al.,
1981.)
изводимую картину разделения. Кроме того, в качестве окрашенного маркера
для двумерных гелей предлагался цитохром с (Leader, 1980), а в качестве
полного набора (pi-Мг)-стандартов - белки головки бактериофага Т4 (Kurian
et al., 1981).
г. Денситометрирование. Отчасти эта тема была рассмотрена в разд.
3.3.3. Кроме процитированных там работ, следует специально отметить ряд
разработанных в последнее время программ для машинного анализа двумерных
электрофореграмм, в особенности полученных с помощью окрашивания
серебром. В самом деле, подобно тому как при двумерном электрофорезе
вместо одной переменной приходится иметь дело с ортогональной системой
координат, отражающей заряд и молекулярную массу белковых компонентов,
так в методе окрашивания серебром по Sammons et al., 1981, появляется
третья независимая переменная - цвет пятна. Помимо расположения на карте
и интенсивности каждое индивидуальное белковое пятно при окрашивании
серебром характеризуется индивидуальными цветовыми оттенками, обычно
различного рода комбинациями желтого, красного, зеленого и синего цветов.
Для количественного выражения этой "третьей координаты" в работе Vincent
et al., 1981, была предложена программа для компьютера, позволяющая
обрабатывать данные цифрового спектрометрирования двумерных
электрофореграмм на нескольких длинах волн. Для этих целей авторы
воспользовались универсальной программой обработки типа LANDSAT,
предназначенной для анализа сложных спектральных сигналов, излучаемых
удаленными спутниками Земли. Таким образом, утверждая, что современный
биохимик должен пройти курс специальной подготовки по астрономии (см.
разд.
Аналитическое ИЭФ
267
3.3.3), я был прав только наполовину. На самом деле он должен выучиться
еще и на астронавигатора.
Другая система компьютерного анализа двумерных белковых карт, получившая
название GELLAB, описана в работе Lemkin, Lipkin, 1981. Программы
сопоставления и коррекции таких карт были предложены также в работах
Taylor et al., 1981, и Kron-berg et al., 1981. Остается надеяться, что
теперь кто-нибудь решится из всего этого разнообразия программ машинной
обработки данных выбрать одну, наиболее доступную и в то же время
наиболее эффективную, т. е. такую программу, которая могла бы с успехом
использоваться во всех лабораториях мира.
д. Применение. Учитывая невероятное разнообразие методов двумерного
фракционирования, вряд ли стоит пытаться целиком охватить столь
необъятную тему. Поэтому я кратко отмечу только последние достижения в
Предыдущая << 1 .. 105 106 107 108 109 110 < 111 > 112 113 114 115 116 117 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed