Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 110

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 104 105 106 107 108 109 < 110 > 111 112 113 114 115 116 .. 171 >> Следующая

обнаружено более 1000 ин-
262
Глава 3
Рис. 3.31. Разделение белков Е. coli, меченных 14С-аминокислотамн in
vivo. После разрушения клеток ультразвуком и обработки ДНКазой и РНКазой
белки растворяли в 9,5 М мочевине в присутствии ноиидета NP-40 (2%),
амфолинов pH 5-7 (2%) и меркаптоэтанола (5%). В гель первого направления
(ИЭФ) вносили 25 мкл образца, содержащего около 10 мкг белка с
радиоактивностью 180000 имп./мин. Во втором направлении (ДДС-Na)
проводили электрофорез в ПААГ (экспоненциальный градиент 9,25-14,4%). При
экспонировании геля в течение 825 ч на радиоавтограмме удавалось
обнаружить около 1000 белковых пятен. (O'Farrel, 1975.)
дивидуальных белковых компонентов. При этом удавалось зарегистрировать и
оценить количественно белковые компоненты, содержание которых составляло
всего лишь 10-6-10-7 от количества суммарного клеточного белка. Пример
использования двумерной карты для анализа белков плазмы человека приведен
на рис. 3.32 (Anderson, Anderson, 1977).
б. Горизонтальная система. Двумерное фракционирование в горизонтальной
системе описано в работах Gorg et al., 1980, 1981. Во втором направлении
разделение осуществляется в плоском тонком геле (толщиной около 360 мкм;
правда, на сегодня представляется более удобным использовать гель
толщиной 0,52 мм), фиксированном на специально обработанной полиэфирной
пленке( см. также разд. 3.2.13). Готовят гель с вог-
Аналитическое ИЭФ
263
нутым экспоненциальным градиентом (4-22,5)% Т (рис. 3.33). На первом
направлении также используется плоский гель толщиной 240 мкм,
полимеризованный на пластиковой подложке. По окончании стадии ИЭФ белки
фиксируют и окрашивают СВВ G-250. После подготовки геля второго
направления от окрашенного первого геля ножницами отрезают нужную полоску
(рис. 3.34), вымачивают ее в течение 2-4 мин в буфере с ДДС-Na и
накладывают на пластину геля для электрофореза в ДДС-Na. На рис. 3.35
показано, как это делается, - полоску геля берут с двух концов пинцетами
за выступающие края подложки и опускают (рабочей поверхностью вниз) в
специальную ложбинку в геле второго направления. Преимущества этой
системы заключаются в том, что за счет использования плоских гелей
улучшается контакт между гелями 1-го и 2-го направлений, благодаря малой
толщине первого геля достигается количественный переход белков во 2-й
гель. Кроме того, процессы урав-
-80 000
О О о о"
от 1 -Антихимотрипсин
......
трипсин ^ ,
0-Цепь гаптоглобина Актин^тромбоцитов
• КИСЛАЯ ОБЛАСТЬ
*Макроглобулин Церулоплазмин L&gBBflQglJ Of,-Антитрипсин
(димер).о^/'^!дй"*.. *
о"*
а1Вгликопротеин^^Гемопе^ин0
ЩЕЛОЧНАЯ ОБЛАСТЬ-
"*¦ Плазминоген
"Активатор фактора С-3 ~Трансферрин
аа HS* гликопротеи!
Нм
а-Цепь фибриногена*1 Ъ-*-------------
Ё Антитромбин Ш
0-Цепь фибриногена ^Т^ЦеТть иммуноглобулина!
Кислый а,-г л ико протеин
-23000
17 000
-13 000
Липопротеины (LDL)
^•Аргинин-обогащенный липопротеин (LDL)
о О <=>
о 1 *
.----------------Легкие цепи иммуноглобулина G -1/
У 90 - НЕЫЦСЭ CTl"
Аполипопротеин А-I (HDL)
Г^о~
а2-Цепь гаптоглобина
Преальбумин
"фа -Цепь
о о
о lr? С'Роос1"и aIS-uenH гапто-° _ глобина
°
полипопротеин A-II (HDL)
Е51
-Цепь гемоглобина
Рис. 3.32. Белковая карта, полученная при окрашивании геля после
двумерного фракционирования белков плазмы крови человека. На карте
помечены положения известных белков. Приведен скорректированный вариант
опубликованной ранее карты, на которой были перепутаны положения а- и у-
цепей фибриногена. (Anderson, Anderson, 1977.)
284
Глава 3
Рис. 3.33. Система для приготовления вогнутого экспоненциального
градиента ПААГ (4-22,5)% Г. Используются стекла от аппарата Multiphor
(фирмы LKB); П-образиая прокладка вырезана из трех слоев парафильма
(толщина геля 360 мкм). В резервуар с мешалкой заливают 5 мл рабочего
раствора мономеров (7=22,5%, С=4%), содержащего 55% глицерина на основе
0,375 М трис-глицииового буфера (pH 8,8), во второй резервуар - 5 мл того
же буфера без акриламида и глицерина. (Gorg et al., 1981.)
новешивания, окрашивания, обесцвечивания фона и высушивания протекают
значительно быстрее, чем в традиционных системах.
в. Маркеры. Когда смотришь на карту двумерного разделения, по которой
разбросано более 2000 белковых пятен, невольно возникает аналогия со
звездным небом в ясную ночь. Астрономам с давних пор было известно, что
для ориентации в звездном небе совершенно необходимо иметь стандартные
точки отсчета. Наиболее простым и эффективным способом получения
стандартов для ИЭФ, по-видимому, является метод ступенчатого
карбамилирования ("carbamylation trains"), описанный в работах Anderson,
Hickman, 1979, и Tollaksen et al., 1981. Известно, что при длительном
нагревании белка в растворе мочевины происходит постепенное
карбамилирование его аминогрупп под действием цианата, образующегося при
разложении мочевины. Потеря белковой молекулой одной свободной
аминогруппы при pH 8,5 вызывает изменение ее суммарного заряда на
Предыдущая << 1 .. 104 105 106 107 108 109 < 110 > 111 112 113 114 115 116 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed