Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
ускоряет удаление ДДС-Na из геля, аскорбиновая кислота и ЭДТА повышают
растворимость белковых компонентов, меркаптоэтанол предотвращает
образование дисульфидных мостиков, а глицерин уменьшает диффузию
низкомолекулярных белковых компонентов.
Рассмотрим теперь более подробно некоторые практические аспекты
проведения двумерного фракционирования. Остановимся на двух вариантах
метода: (а) вертикальной системе (O'Far-tell, 1975) и (б) горизонтальной
системе с применением уль-тратонких гелей (Gorg et al., 1980, 1981).
а. Вертикальная система. Конструкция формц'для приготовления геля
второго направления представлена на рис. 3.30. Пластина геля второго
направления шириной 16,4 см, высотой
14,6 и толщиной 0,8 мм включает разделяющий гель с экспоненциальным
градиентом полиакриламида (10-16% Т) и концентрирующий гель (4% Т).
Пропись, по которой готовятся цилиндрический гель первого направления
(ИЭФ) и пластина геля второго направления (электрофорез в ДДС-Na),
приведена в табл.
3.12. Лизированные клетки, выращенные в присутствии 14С-ами-
17*
Глава 3
нокислот, после обработки ДНКазой и РНКазой экстрагируют раствором 9,5 М
мочевины, содержащим 5% меркаптоэтанола, 2% NP-40, 1,6% амфолинов pH 5-7
и 0,4% амфолинов pH 3,5-10. При работе с радиоактивными образцами для
одного опыта достаточно около 20 мкг суммарного белка, а при
необходимости окрашивания СВВ в гель первого направления следует вносить
около 100-250 мкг белка. После ИЭФ (см. табл.
3.12, А) гель вымачивают два раза по 60 мин в двух порциях (по 5 мл)
исходного 62,5 мМ трис-HCl-буфера, содержащего 2,3% ДДС-Na, 5%
меркаптоэтанола и 10% глицерина. Контакт между цилиндрическим гелем
первого направления и пластиной геля второго направления осуществляется
при помощи концентрирующего геля (4%Т) или 1%-ного агарозного геля. В
работе Imada, 1978, предложено проводить электрофорез в геле,
расположенном между непараллельными стеклянными пластинами, угол между
которыми составляет 6,5°, что облегчает процесс соединения
цилиндрического и плоского гелей первого и второго направлений
соответственно. В тех случаях, когда требуется проводить электрофорез
содержимого нескольких цилиндрических гелей в нескольких пластинах ДДС-
Na-ПААГ, можно пользоваться системами, описанными в работе Anderson,
Anderson, 1978а, b. Установка для нескольких параллельных двумерных
разделений (ИЭФ-электрофорез в ДДС-Na) получила название "ИЗО-ДАЛЬТ",
указывающее на то, что разделение основано на ИЗОэлектрофокусировании (т.
е. на различии в заряде) в первом направлении и на различии в
молекулярной
А Вертикальный разрез собранной формы
Б Передняя пластина (внутренняя сторона)
I
Задняя
пластина
В Задняя пластина (внутренняя сторона)
)4
Н-164-
Г Общий вид 4
гГ11
Задняя пластина
Передняя пластина ,
Рис. 3.30. Конструкция формы для приготовления пластины геля второго
направления. После ИЭФ в первом направлении цилиндрический гель помещают
в верхнюю часть пластины ПААГ для проведения ДДС-Ма-электрофореза во
втором направлении. Все размеры приведены в миллиметрах. 1 - эпоксидная
смола, 2 - гель после ИЭФ. (O'Farrell, 1975.)
Аналитическое ИЭФ
261
Таблица 3.12. ИЭФ - электрофорез в ДДС-Na (O'Farrell, 1975)
А. Приготовление геля первого направления (ИЭФ)
Для получения 10 мл геля смешивают:
5,5 г мочевины (сверхчистой)
1,33 мл раствора, содержащего 28,38% акриламида, 1,62% бис
2 мл 10%-ного нонидета NP:40
0,4 мл 40%-ных амфолинов '(pH 5-7)
0,1 мл 40%-ных амфолинов (pH 3,5-10)
1,95 мл воды
10 мкл 10%-ного персульфата аммония 5 мкл ТЕМЭД
Б. Приготовление геля второго направления (электрофорез в ДДС-Na)
Разделяющий градиентный гель Легкий раствор:
4 мл 0,4%-иого ДДС-Na в 1,5 М трис -НС1, pH 8,8
5.3 мл раствора, содержащего 29,2% акриламида, 0,8% биса
6.7 мл воды
8 мкл ТЕМЭД
25 мкл 10%-ного персульфата аммония Тяжелый раствор:
2 мл 0,4%-ного ДДС-Na в 1,5 М трис - НС1, pH 8,8
4.3 мл раствора, содержащего 29,2% акриламида, 0,8% биса,
1.7 мл 75%-ного глицерина
4 мкл ТЕМЭД
10 мкл 10%-ного персульфата аммония
Концентрирующий гель
-1,25 мл 0,4%-ного ДДСпИа в 0,5М трис - НС1, pH 6,8 0,75 мл раствора,
содержащего 29,2% акриламида, 0,8% биса 3,0 мл воды
5 мкл ТЕМЭД
15 мкл 10%-ного персульфата аммония
массе (выражаемой в ДАЛЬТонах) во втором направлении. На базе этой
системы был также сконструирован прибор для электрофореза в восьми
пластинах ПААГ одновременно (Dean, 1979), "комплементарный" традиционному
восьмитрубочному электрофоретическому аппарату. В работе Ruchel, 1977.,
была описана методика двумерного микрофракционирования с использованием
пластин геля размером с почтовую марку (линейный размер около 1 см).
Системы микроэлектрофореза в градиенте пористости геля были использованы
в работах Matsudaira, Burgess, 1978; Ogita, Market, 1979, и Poehling,
Neuhoff, 1980 (см. также разд. 3.2.17).
Пример картины разделения, полученной при двумерном ИЭФ-электрофорезе в
ДДС-Na, показан на рис. 3.31. Этим способом в лизате клеток Е. coli было
