Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
на подвижности, что соответственно снижает эффективность разделения
(Rodbard et al., 1974). Для решения этой: проблемы в работе Kenrick,
Margolis, 1970, описанная выше методика была модифицирована таким
образом, чтобы разделение сфокусированных белков во втором направлении
происходило-только на основании различий в размерах молекул. Авторы
использовали пластины геля с вогнутым градиентом концентрации акриламида
4,5-26%. При электрофоретической миграции в таком геле белки достигают
квазистационарного положения, которое определяется их молекулярным
размером или стоксовым радиусом. Такой подход позволяет не только
повысить разрешение, но и одновременно оценить значение Мт нативного
белка. Вопрос состоит в том, можно ли в принципе с помощью электрофореза
в градиенте пористости геля (в отсутствие ДДС-Na) точно определить Мг
нативного белка. Эта проблема, вызывающая серьезные разногласия,
специально исследовалась в работе-Lambin, Fine, 1979. Авторы показали,
что при градиентном: электрофорезе существует линейная зависимость между
расстоянием миграции белков и квадратом времени электрофореза. Построив
соответствующие кривые для стандартных белков с известной молекулярной
массой, по их наклону можно получить, достаточно точные оценки Мт
исследуемых нативных белков.
Один из вариантов этого метода был описан в работе Fel-genhauer, Рак,
1975. В первом направлении проводилось ИЭФ-в слое гранулированного геля
(сефадекс G-75SF),' а во втором - электрофорез в линейном градиенте (3-
30%) ПААГ. Применение гранулированного геля на первой стадии ускоряет
процесс достижения равновесия ИЭФ для таких крупных белков, как ферритин,
аг-макроглобулин и p-липопротеин, а также позволяет проводить быстрое
детектирование сфокусированных зон с помощью метода бумажных реплик
(Radola, 1973а, см. также разд. 2.2.3). Слой сефадекса при ИЭФ
располагается На тонкой (0,15 мм) пластиковой пленке, благодаря этому по
356
Глава 3
окончании фокусирования полоску геля можно легко отрезать и перенести на
пластину ПААГ второго направления. Электро-•форез в градиентном геле в
данном случае проводится в горизонтальной пластине, контакт которой с
электродными резервуарами осуществляется с помощью бумажных фйтилей. В
процессе электрофореза, в том случае, если каждый компонент белковой
смеси достигает положения, соответствующего его пределу эксклюзии
(Felgenhauer, 1974), реализуется квазистацио-нарное состояние. При этом
удается достаточно точно оценить молекулярную массу разделяемых белков
(Andersson et al., -1972; Riichel et al., 1973).
•3.4.4. Изоэлектрофокусирование - изотахофорез (ИЭФ-ИТФ)
Этот метод двумерного фракционирования был описан в варианте с обратной
очередностью стадий: ИТФ-ИЭФ. С помощью перекрестного ИТФ-ИЭФ можно
исследовать различия между принципами, лежащими в основе этих методов
разделения. В предложенной методике ИТФ проводили в тонкой
'горизонтальной пластине ПААГ; вырезали полоску геля, накладывали ее на
пластину геля второго направления (толщиной "0,5 мм) со стороны катода и
проводили ИЭФ. Последовательное проведение ИТФ и ИЭФ сочетает в себе
преимущества высокой .разрешающей способности каждого из методов, а также
позволяет преодолеть их некоторые специфические ограничения. Так, •белки
с очень близкими значениями pi удается разделить с помощью ИТФ при таком
значении pH, при котором эти белки заметно различаются по
электрофоретической подвижности. С другой стороны, белки со сходной
зависимостью подвижности от рн в области pH, при котором проводится ИТФ,
но различающиеся по pi при ИТФ будут мигрировать вместе, но разделятся
при ИЭФ (Brogren, 1977).
3.4.5. ИЭФ в "гпоперечном" градиенте концентрации мочевины
Использование градиента концентрации мочевины в геле является весьма
интересным приемом при анализе четвертичной структуры белков (Hobart,
1975). Полиакриламидный гель заливают между стеклянными пластинами таким
образом, чтобы градиент концентрации мочевины оказался ориентированным
под углом 90° к направлению электрического поля. Образец наносят по всей
ширине геля с помощью длинной полоски фильтровальной бумаги параллельно
электродам. Таким образом, фокусирование образца будет происходить на
участках с различным (плавно нарастающим) содержанием мочевины. Инфор-
Аналитическое ИЭФ
257
мация, которая может быть получена в экспериментах такого Уода,
проиллюстрирована в общем виде на рис. 3.29. В случае "Ковалентно
связанных (т. е. не диссоциирующих в присутствии ^мочевины) структур
белковая зона выглядит как прямая линия Ь тех случаях, когда денатурация
не сопровождается изменением pi (рис. 3.29,а). Изменение pi при
денатурации может про-
Ковалентно Нековалентно
связанные структуры связанные субъединицы
Увеличение концентрации Увеличение концентрации
мочевины в геле мочевины в геле
Рис. 3.29. Различные варианты распределения полипептидных зон при ИЭФ
нативных или частично ацетилированных белков в плоских гелях в
