Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 105

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 99 100 101 102 103 104 < 105 > 106 107 108 109 110 111 .. 171 >> Следующая

предлагалось использовать сочетание двух акриламидных гелей с разной
пористостью (Raymond, Nakamichi, 1964; Holmes, 1967; Kaltschmidt,
Wittman, 1970a) и даже с разными значениями pH .разделения (Kaltschmidt,
Wittman, 1970b; Fahnestock et al., 1973; Held, Nomura, 1973). Сочетая
электрофорез по заряду с электрофорезом в градиенте пористости геля
(Margolis, Kenrick, ,1967, 1968),
удалось повысить разрешение и одновременно связать положение белков на
карте с их физико-химическими параметрами. Однако поистине новый этап в
развитии методов двумерного фракционирования наступил лишь с появлением
ИЭФ - метода, чувствительного только к суммарному заряду белковой
молекулы, который можно применять в сочетании с другими элект-
250
Глава 3
Электрофорез в ДСН (М субъединиц)
Электрофорез в градиентном геле (М г нативных белков, стоксов радиус)
Обычный электрофорез в геле (белковая карта)
Иммуноэлектрофорез
Электрофорез перпендикулярно стационарному градиенту pH (кривая
титрования)
L-e
о
S
Изотахофорез
Второе направление
Рис. 3.26. Варианты метода двумерного фракционирования, в которых первой
стадией разделения является ИЭФ. (Gianazza, Righetti, 1979.)
рофоретическими методами, основанными на разделении только по размеру, по
размеру и заряду, а также по иммунологическим свойствам. Настоящее
обсуждение будет ограничено только методами такого типа, которые отражены
на рис. 3.26. На этом рисунке ИЭФ фигурирует как первая стадия
фракционирования, хотя в отдельных случаях порядок стадий может быть и
обратным. Впрочем, как правило, на первой стадии используется именно ИЭФ,
которое позволяет анализировать очень разбавленные, непригодные для
электрофореза образцы и обеспечивает получение очень узких зон, что
существенно повышает качество разделения на второй стадии. Кроме того,
применение электрофореза после ИЭФ приводит к удалению амфолитов, что
облегчает последующий процесс окрашивания белков в геле.
3.4.1. ИЭФ - иммуноэлектрофорез (или иммунофиксация)
После ИЭФ можно проинкубировать гель непосредственно в буферном растворе,
содержащем соответствующую антисыворотку (Carrell et al., 1969; Powell et
al., 1975). Для определения фенотипических вариантов ai-антитрипсина был
использован метод "иммунной реплики", для чего на полиакриламидный гель
после ИЭФ накладывали полоску ацетилцеллюлозы, содержащую соответствующие
антитела (Arnaud et al., 1977). С той же целью в работе Johnson, 1978,
использовались методы прямой и непрямой иммунофиксации. При ИЭФ в плоском
геле для детектирования определенного белка можно наслоить небольшой
объем (25-50 мкл/см2) неразбавленной моноспецифи-ческой антисыворотки
непосредственно на тот участок геля, где фокусируется данный белок. Это
позволяет экономно расходовать антисыворотку, а также одновременно
определять различ-
Аналитическое ИЭФ
251
ные антигены, наслаивая разные антисыворотки в различных треках и на
различные участки геля (Stibler, 1979).
Описаны и другие варианты метода иммуноэлектрофокусирования. Некоторые
наиболее распространенные варианты продемонстрированы на рис. 3.27.
Например, столбики или полоски геля после ИЭФ можно поместить в агарозный
гель, содержащий антитела, и затем провести электрофорез сфокусированных
белков в перпендикулярном направлении (перекрестное
иммуноэлектрофокусирование). Комплексы антигенов с антителами образуют
конусообразные зоны преципитации, по площади которых можно достаточно
точно определить концентрацию антигена, аналогично методу ракет Лорелла
(Laurell, 1966). Этот метод позволяет также исследовать иммунологические
взаимоотношения двух близко расположенных антигенов (Alpert et al.,
1972). Оказалось, однако, что при проведении иммуноэлектрофореза
сфокусированных антигенов возникают серьезные проблемы вследствие
контакта полиакриламидного и агарозного гелей. Различие в
электроосмотических свойствах этих двух гелей приводит к тому, что -в
процессе электрофореза происходит накопление воды в полиакриламидном геле
со стороны анода и высыхание агарозного геля возле границы с
полиакриламидом со стороны катода. Эти процессы часто приводят к
размыванию
Столбик* или полоска ш- Сегменты
Двойная диффузия
Перекрестный иммуноэлектрофорез
Антисыворотка Отмывка Окрашивание
ИММУНО-
ИЗОЭЛЕКТРОФО-
КУСИРОВАНИЕ
Агарозный гель +
U
Lu
Ui
Иммуноэлектрофорез
Иммуноадсорбция
Рис. 3.27. Различные варианты сочетания ИЭФ с иммунологическим анализом в
геле. (Catsimpoolas, 1973с.)
252
Глава 3
и искажению кривых иммунопреципитации. Практически полностью эту проблему
удалось решить с помощью метода наложения полосок геля (Smyth et al.,
1977). На рис. 3,28 А-3 показана последовательность операций,
используемых в этой методике. При работе необходимы скальпель со сменными
ножами, длинное лезвие 20X150 мм, например типа Triumph Glass Cleaner, и
еще одно такое же лезвие, зафиксированное на плексигласовой пластинке.
После ИЭФ электродные полоски вместе с соответствующими участками геля
Предыдущая << 1 .. 99 100 101 102 103 104 < 105 > 106 107 108 109 110 111 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed