Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
1576.
39. Howlett S. K-, Bolton V. N. (1985). J. Embryol. Exp. Morphol., 87,
175.
ГЛАВА 9
СОЗДАНИЕ БИБЛИОТЕК иДНК ДЛЯ ПРЕДИМПЛАНТАЦИОННОГО ЭМБРИОНА МЫШИ
Кристина Уотсон, Джози МкКоннел1
1. Введение
Длительные клеточные циклы и "стойкость" мышиного эмбриона в отношении
экспериментальных манипуляций позволили довольно детально изучить на
клеточном уровне ранний эмбриогенез мыши [1, 2] (гл. 2 и 3). Однако для
анализа молекулярных событий, лежащих в основе наблюдаемых
морфологических изменений, предимплантационный эмбрион мыши нельзя
назвать подходящей системой. Только в последнее время с
усовершенствованием методов получения рекомбинантных ДНК появилась
возможность приступить к изучению эмбрионального развития на молекулярном
уровне.
Основная трудность, возникающая при биохимическом или молекулярном
анализе, связана с малыми размерами эмбрионов и ограниченностью их числа:
установлено, что каждый ооцит мыши содержит около 0,35 пг тотальной РНК
[3] и даже суперовуляция (гл. 1, разд. 5.4) не дает возможности получить
от одной мыши более 30 ооцитов.
Несмотря на эти ограничения, накопился достаточный объем биохимических
данных о ранних стадиях развития [4]. Было установлено, что в течение
первых двух клеточных циклов функционирует мРНК, унаследованная от
матери, затем ее большая часть (если не вся) разрушается и уступает место
мРНК, транскрибированной с генома эмбриона [5-8]. Более тщательный анализ
белков, кодированных материнскими транскриптами, показал, что их набор
изменяется в зависимости от клеточного цикла [9].
Один из подходов к пониманию того, как информация от генов переходит к
белкам, заключается в анализе популяций мРНК на разных стадиях развития
эмбриона. Избирательная деструкция или активация индивидуальной мРНК,
выявленная в ходе этого анализа, может указать на ее роль в конкретных
событиях развития. Для такого анализа необходимо создание
1 Christine J. Watson. Department of Biochemistry and Microbiology,
University of St Andrews, St Andrews KY 16 9AL, UK.
Josie McConnell. Department of Anatomy, University of Cambridge, Downing
Street, Cambridge CB2 3DY, UK.
240
Библиотека кДНК Для предимплантацнонного эмбриона мыши 241
библиотек комплементарной ДНК (кДНК) на основе мРНК, экстрагированных на
разных стадиях развития. Однако, как упоминалось выше, такой подход
серьезно ограничивается количеством доступного исследователю материала.
Не удобны в качестве модельной системы и клетки эмбриональной карциномы
(эю [ioj. так как они не происходят от зиготы и, следовательно, не могут
имитировать раннее эмбриональное развитие. Исходя из необходимости
использовать РНК ооцита и РНК поздних стадий эмбрионального развития,
следует так усовершенствовать все методики, чтобы компенсировать малый
объем экспериментального материала.
На основе векторной системы бактериофага может быть обеспечена очень
высокая эффективность клонирования - порядка 2хЮ7 бляшкообразующих единиц
(БОЕ) на микро-грамм двухцепочечной ДНК [11], что дает возможность
обойтись очень малым количеством исходной ткани. Число индивидуальных
клонов, которое обеспечивает 99%-ную вероятность клонирования
определенной мРНК в пределах популяции, можно рассчитать по формуле:
N = ln(l - Р)/1п(1 - 1/я),
где N-число требуемых клонов, Р - вероятность получения данной
последовательности и 1/я - доля отдельных фракций в популяции тотальной
мРНК [12]. Например, в клеточной линии фибробластов человека,
трансформированных SV40, число различных последовательностей класса с
низкой копийностью (~ 14 копий на клетку) равно 10 670 и представляет 29%
мРНК [13]. В таком случае п-10 670/0,29 и равно 36 790. Следовательно,
чтобы обеспечить 99%-ную вероятность клонирования низкокопийной мРНК
требуется около 169 000 клонов. Если допустить, что структура популяции
РНК эмбриона такая же, как в приведенном примере, можно заключить, что
полную библиотеку должны составить 200 000 клонов. В табл. 9.1
перечислено количество эмбрионов мыши различных стадий развития, которое
дает минимальный объем РНК, необходимый для создания полной библиотеки
современными средствами. По мере усовершенствования каждой процедуры эти
значения могут быть уменьшены, но, скорее всего, незначительно.
Исключительная ценность библиотек эмбриона определяется следующими
причинами:
а) используя технику дифференциального скрининга, можно выделить из
библиотеки последовательности, экспрессирующиеся на разных стадиях
развития [15];
б) можно количественно охарактеризовать экспрессию определенных
клонируемых последовательностей в ходе
16-171
.242
Глава 9
Таблица 9.1. Содержание РНК в предимплантационных эмбрионах
Стадия развития Всего РНК на эмбрион, иг1) Оценка ро1у(А) + РНК иа
эмбрион, ш-) Число эмбрионов для полной библиотек#)
Ооцит 0,35 7,0 14 286
1-клеточная 0,42 8,3 12 048
Поздняя 2-клеточная 0,24 2,6 38 461
8-16-клеточная 0,69 4,4 22 727
32-клеточная 1,47 14,2 7 042
') На основании данных Пико и Клегга |31.
