Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
течение примерно 1 минуты. Внесите ТЭМЕД и немедленно загрузите смесь в
трубки, воспользовавшись для этого шприцем с длинной иглой. Загружая
смесь через дно трубок, позаботьтесь о том, чтобы не возникли пузырьки
воздуха.
3. Наслоите сверху 20 мкл покрывающего раствора мочевины (табл. 8.7).
Спустя 1,5 ч замените его 24 мкл лизнрующего буфера (табл. 8.7), а затем
10 мкл воды. Чтобы избежать кристаллизации мочевины, поместите трубки
перед инфракрасной лампой.
4. Спустя еще 1,5 ч наполните иижний электродный резервуар 10 мМ
фосфорной кислотой. Удалите парафилм с каждой трубки и поместите по-
лимеризованные гели в верхний электродный резервуар.
5. Удалите раствор, покрывающий сверху каждый гель и замените его 20 мкл
свежего лизнрующего буфера.
6. Заполните верхнюю часть каждой трубки дезаэрированным 20 мМ NaOH.
Наполните верхний резервуар тем же раствором. Проведите предварительный
электрофорез в течение 15 мни при 200В, 30 мин при 300В и 30 мин при
400В.
7. Выключите питание и удалите лизнрующий буфер и буфер из верхнего
резервуара. Теперь гели готовы для загрузки.
8. Убедитесь в том, что в образцах достаточно мочевины, трижды проведите
их через процедуру замораживания - оттаивания, а затем загрузите в лунки
при помощи гамильтоновского шприца или микропипетки (Eppendorf).
9. Наслоите на образцы 10 мкл покрывающего раствора (табл. 8.7), сверху
каждую трубку осторожно заполните 20 мМ NaOH и снова наполните верхнюю
камеру. Разделение эффективно при суммарном напряжении 6000В, причем в
течение последнего часа оно должно составлять 800В. (Например, разделяйте
при 325В в течение 16 ч плюс 800В в течение 1 ч).
10. Извлеките гели из трубки, воспользовавшись наполненным водой шприцем,
соединенным с коротким куском шланга, второй конец которого надевается на
конец трубки. Осторожно увеличивая давление в шприце, выдавите гель из
трубки11.
11. Если предполагается анализировать белки только с помощью ИЭФ, сразу
высушите гели.
12. Для разделения во втором направлении уравновесьте гели 5 мл ДСН-бу-
фера для образцов (который следует менять каждые 15 мин) в течение 2 ч.
Храните гели в ДСН-буфере для образцов при -70 °С или сразу ведите
электрофорез во втором направлении.
13. Для разделения во втором направлении положите трубчатый гель вдоль
края пластинки 10%-ного акриламидного геля (приготовленного точно по
рецепту, описанному в табл. 8.5 и 8.6), который отлит между
соответствующим образом измененными стеклами (см. работы [4, 20]).
Приготовьте концентрирующий гель в соответствии с указанием табл. 8.6.
Гребенку для лунок замените куском тефлона, обеспечивающим плоскую
поверхность для укладки трубчатого геля. Удалите тефлоновую форму
232
Качественный анализ белков ранних эмбрионов мыши
233
Продолжение табл. 8.9
после полимеризации концентрирующего геля. Удалите весь неполиме-
ризованнын материал. Налейте около 1 мл 1%-ной расплавленной агарозы
поверх концентрирующего геля (чтобы прикрепить трубчатый гель) н
осторожно поместите трубчатый гель на агарозу (позаботьтесь о том, чтобы
под гелем не образовались пузырьки воздуха). Спустя приблизительно 2 мии
наполните верхний резервуар буфером для разделения (табл. 8.4).
Разделяйте полипептиды в соответствии с молекулярной массой, как описано
в табл. 8.6.
•) Если требуется оценить градиент pH, незагруженный ИЭФ-гель нарезают на
пластинки, которые элюируют 1 мл дезаэрированной дистиллированной воды в
течение нескольких часов и в каждой измеряют pH.
ления в первом направлении : например, при работе с основными белками
полезно воспользоваться электрофорезом с несбалансированным градиентом pH
[22J. Несмотря на громадные возможности двумерных гелей,
воспроизводимость и сопоставимость результатов, полученных с их помощью,
остаются серьезной проблемой. Без компьютерных программ, позволяющих
стандартизировать данные, интерпретация результатов весьма сложна.
Общее разрешение двумерных гелей в большой степени зависит от вклада ИЭФ.
Процедура работы с ИЭФ-гелями в пределах pH 4,5-7,0 детально описана в
табл. 8.7, 8.8 и 8.9. Заметьте, что смеси амфолинов могут обеспечить
широкие интервалы pH (от 2 до 10) или особо узкие (при этом как лизирую-
щий буфер, так и буфер для приготовления образца, должны иметь одно и то
же значение pH).
4. Анализ белков, разделенных с помощью электрофореза в гепе
4.1. Обнаружение радиоактивно меченных белков; сравнение методов
радиоавтографии и флюорографии
Обнаружение радиоактивно меченных белков, разделенных с помощью ПААГ, -
метод значительно более чувствительный, чем окрашивание немеченых белков.
Стратегия выявления белков (радиоавтография высушенного геля или окраска
флуоресцирующим веществом) определяется типом используемого изотопа [25,
26J. Прямая радиоавтография дает удовлетворительные результаты при
использовании энергии излучения 32p/i25j Применение интенсифицирующего
экрана повышает чувствительность, однако при этом снижается разрешающая
