Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 93

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 87 88 89 90 91 92 < 93 > 94 95 96 97 98 99 .. 162 >> Следующая

постоянном токе 20 мА, пока фронт красителя ие окажется иа расстоянии
примерно 5 мм от дна геля. Это происходит примерно через 4 ч.
229
230
Глава 8
Продолжение табл. 8.6
15. Закончив электрофорез, немедленно фиксируйте гель, чтобы предупредить
диффузию белков (если гель не предназначается для блоттиига, см. табл.
8.11). Для этого в течение 20-30 мин инкубируйте гель в смеси 45%-ного
метанола с 10%-ной уксусной кислотой, вместо иее можно использовать 50%-
ную ТХУ.
16. Используйте систему маркирования углов геля. Этот прием позволит вам
различать гели между собой и ориентировать их при последующих процедурах.
(Если гель на этой стадии предназначен для хранения, его помещают в 7%-
ную уксусную кислоту.) Затем гель может быть использован для
флюорографии, прямой радиоавтографии (см. разд. 4.1) или окрашивания
серебром (см. табл. 8.10).
17. Очистите гель средством для снятия крема (которое не поцарапало бы
его поверхность) и маленькой губкой, хорошо сполосните водой, затем 70%-
ным спиртом и осушите материалом, не оставляющим волокон.
номерное распределение белков и используется наиболее часто (см. рис.
8.1, 8.2 и 8.4). В табл. 8.4, 8.5 и 8.6 подробно изложена методика работы
с таким гелем Он содержит 0,4% ДСН и 0,5 М трис-НС1 (pH 8,8). В систему
входит концентрирующий гель из 4,5%-ного акриламида с 0,4% ДСН и 0,125 М
трис-НС1 (pH 6,8). Если количество метки известно, образцы с одинаковой
(или известной) радиоактивностью лучше поместить на соседние дорожки. Это
позволит более точно оценить изменения индивидуальных белков в популяции.
Для полуколичественно-го сравнительного анализа полипептиды из образцов,
обычно содержащих равное число эмбрионов на одной стадии развития, могут
быть разделены на соседних дорожках. Пример, иллюстрируемый рис. 8.2,
показывает изменение паттерна белков, синтезированных в ходе
предимплантационного развития. На геле представлено равное число [10]
меченных [35S]-метионином иеоплодотворенных яиц, эмбрионов на 1-, 2-, 4-,
8-, 16-клеточной стадиях, на стадии ранней кавитации и 6 эмбрионов на
стадии поздней бластоцисты.
3.2. Изоэлектрическое фокусирование и двумерные гели
Двумерные гели с высоким разрешением позволяют разделять и различать до
1200 полипептидов. Метод был предложен О'Фареллом [20], последующие
модификации позволили повысить разрешение, воспроизводимость и упростить
процедуру [22, 23]. В основе этого метода лежит разделение белков в
соответствии с их изоэлектрической точкой в цилиндрических
полиакриламидных гелях (изоэлектрофокусирующнй электрофорез, ИЭФ). В
результате различные белки оказываются сегрегированными в виде дискретных
узких зон [24]. Новая ("flat-bed") система позволяет производить
разделение электрофокусирова-
Качественный анализ белков ранних эмбрионов мышн
231
Таблица 8.7. Исходные растворы для приготовления
изоэлектрофокусирующих гелей
Компонент геля
Хранение
Лидирующий буфер: 9,5 М мочевина; 5% 2-мер-каптоэтанол; 2% NP-40;
1,6% амфолииы 5-7;
0,4% амфолииы 3,5-10 Акриламид: бисакриламид 28,83% : 1,62% (В) 10%-ный
NP-40 Амфолины pH 3,5-10 и 5-7 10%-ный персульфат аммония 10 мМ Н3РО4
20 мМ NaOH
Покрывающий раствор: 8 М мочевина Покрывающий раствор для образца:
9 М мочевина; 0,8% амфолины, 5-7; 0,2% ам-фолнны, 3,5-10 ДСН-буфер для
приготовления образца;
62,5 мМ трнс-НС1 pH 6,8; 2,3% ДСН; 5% 2-меркаптоэтанол; 10% глнцерол
Заморозить
4°С в темной посуде Комнатная температура 4 °С
4°С, до 1 месяца 1 М исходный раствор, комнатная температура
Комнатная температура
Заморозить
Заморозить
4 °С
Таблица 8.8. Рецепт приготовления изоэлектрофокусирующего геля
Ингредиент (см. табл. 8.7) Количество1)
Мочевина (г) 5,5
Раствор В (мл) 1,33
NP-40 2,0
Вода (мл) 1,97
Амфолины 3,5-10 (мл) 0,1
Амфолины 5-7 (мл) 0,4
Персульфат аммония (мкл) 10
Дезаэрация
ТЭМЕД (мкл) 7
') Достаточное для приготовления 10 гелей.
нием нескольких образцов в одном пластинчатом геле, что повышает
воспроизводимость результатов [21J. ИЭФ может применяться отдельно, но
чаще сочетается с электрофорезом во втором направлении, разделяющим
полосы на серию пятен, из которых каждое обычно соответствует
индивидуальному полипептиду (см. рис. 8.3). ИЭФ - не единственный способ
разде-
Таблица 8.9. Процедура разделения с помощью изоэлектрофокусирования
и двумерных гелей
1. Залейте ИЭФ-гели в трубки, залепленные с одного конца парафилмом.
Важнейшее значение имеет чистота трубок (их следует выдержать в хромовой
кислоте, тщательно промыть бидистиллнроваиной водой, сполоснуть спиртом и
высушить).
2. Приготовьте в 125-мл колбе с боковым отводом гелевую смесь
(достаточную для заполнения 10 трубок, с pH 4,5-7) из мочевины, исходного
раствора В акриламида (табл. 8.7), NP-40, бидистиллированной воды н смеси
амфолннов (LKB или Servolyte), как описано в табл. 8.8. Слегка вращайте
колбу (можно немного подогреть), пока мочевина не растворится полностью.
Добавьте персульфат аммония. Проведите дезаэрацию смеси в вакууме в
Предыдущая << 1 .. 87 88 89 90 91 92 < 93 > 94 95 96 97 98 99 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed