Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 91

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 85 86 87 88 89 90 < 91 > 92 93 94 95 96 97 .. 162 >> Следующая

Процентное содержание ДСН в буферах для образцов и отмывки можно
уменьшить, зто даст возможность получить больший специфический сигнал на
фоне неспецифического связывания.
дуцируется вторичным антителом). Для контроля степени неспецифического
взаимодействия следует параллельно провести "преципитацию" предиммунной
или неиммунной сывороткой. Антитела, полученные на природный белок, более
уместно использовать для этого метода, чем для блоттинга. В табл. 8.3
описана методика, разработанная для применения аутоиммунной антисыворотки
против ламина В. Другие процедуры подробно изложены в работе [16].
15-171
226
Глава 8
Таблица 8.4. Исходные растворы для одномерных гелей
Буфер
Хранение
Буфер для приготовления образцов:
62.5 мМ трис-НС1, pH 6,8 2% ДСН;
5% 2-меркаптоэтанол; 10% глицерол; 0,002% бромфеиолоный синий
Акриламид : бисакриламид 30%: 0,8% (А) 0,5 М трис-НС1, pH 6,8; 0,4% ДСН
(ВГБ'>)
1.5 М трис-НС1, pH 8,8; 0,4% ДСН (НГБ2) 10% персульфат аммония
Буфер для разделения:
25 мМ трис-НС1, pH 8,3;
192 мМ глицина;
0,1% ДСН
4 °С
4,°С, в темной посуде 4 °С 4 °С
4°С, можно хранить до 1 месяца
Удобно хранить в десятикратной концентрации при комнатной температуре, pH
доно-дить глицином до 8,3
') ВГБ - верхний гелевый буфер. 2) НГБ- нижний гелевый буфер.
2.6. Приготовление образцов
Промойте образцы, проведя через две капли культуральной среды М2 или М16
+ БСА (гл. 2, разд. 5.2), затем через несколько капель культуральной
среды М2 или Ml6 без БСА. Перенесите эмбрионы группами в эппендорфовские
пробирки, содержащие по 10-30 мкл буфера для образцов (табл. 8.4; [19])
для одномерного анализа или лизисного буфера (табл. 8.7; [20]) для
двумерного анализа. Большее число эмбрионов требует большего объема
буферов. Следы БСА должны быть минимальны: этот немеченый белок
разрушающе действует на гель. Проколите каждую пробирку иглой и кипятите
в водяной бане в течение 2 мин, затем храните при -70 °С. Что касается
меченых образцов, то существует зависимость между типом использованного
изотопа, длительностью периода мечения, стадией эмбрионального развития и
числом эмбрионов на дорожку геля. Так, яйца и эмбрионы вплоть до 8-
клеточной стадии метят [36S]-метионином в течение 1 ч группами по 10 штук
для одномерного анализа или по 30-50 для двумерного анализа; применение
флюорографии дает результаты через 4-7 дней. Для одномерного анализа
вполне можно использовать единичный эмбрион, но при этом увеличивается и
период мечения, и время экспозиции.
Качественный анализ белков ранинх эмбрионов мыши
227
2.7. Количественные измерения включенной метки
Может возникнуть необходимость определения количества включенной в
эмбрион метки и (или) количества меченого предшественника, связанного
эмбрионом. В этом случае можно количественно оценить синтез белка, в
частности, скорость синтеза индивидуальных белков. Процедура заключается
в следующем.
1. Отмойте эмбрионы, инкубировавшиеся в среде с мечеными аминокислотами
или сахарами, и соберите, как указано в разд. 2.6.
2. Отберите аликвоты по 1-3 мкл (при общем объеме 10-¦ 30 мкл) из буфера
для образцов или лизисного буфера для количественного анализа.
3. Для оценки поглощения меченого предшественника аликвоту поместите
непосредственно в сцинтиллят.
4. Для оценки включения в белок аликвоту добавьте к смеси 500 мкл воды с
25 мкл 0,1%-ного БСА (в качестве
ко-преципитата) и осаждайте белки добавлением 500 мкл 10%-ной
трихлоруксусной кислоты (ТХУ).
5. Оставьте образцы на 1-2 ч при 4°С, затем профильтруйте через
миллипоровый фильтр, дважды промойте 10%-ной ТХУ, дважды 70%-ным этанолом
и дайте высохнуть.
6. На каждом из фильтров определите связавшуюся радиоактивность с помощью
сцинтилляционного счетчика.
При мечении [35S]-метионином в течение 1 ч с использованием тех удельных
активностей, которые рекомендованы в разд. 2.1.1, можно ожидать значений
порядка 400-500 имп/мин па эмбрион.
3. Электрофорез в полиакриламидном геле
Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) служит мощным аналитическим
средством разделения и идентификации белков. Присутствие ДСН обеспечивает
белок отрицательным зарядом, вследствие чего заряд на единицу массы
остается приблизительно постоянным. Поэтому для большинства белков
электрофоретическая подвижность комплекса практически полностью
определяется их молекулярной массой. Технические детали применения одно-
и двумерных гелей приведены в работе [2]. Кроме того, использование гель-
электрофореза белков применительно к эмбрионам млекопитающих обсуждается
Ван Блеркомом [4]. Здесь мы попытаемся изложить достаточно подробно
принципы вертикального ДСН-электрофореза.
В последнее время все чаще пользуются тонкими (0,1- 0,3 мм) и
миниатюрными (мини-) гелями [4]. Для гелей тради-
228
Глава 8
Таблица 8.5. Рецепт для приготовления одномерных гелей
Исходный раствор (см. табл. 8.4) Разделяющий гель Концентрирующий гель
А (мл) ВГБ (мл) НГБ (мл) Вода (мл) 8 8 8 1.5 2.5 6
Предыдущая << 1 .. 85 86 87 88 89 90 < 91 > 92 93 94 95 96 97 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed