Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
объекта удалось разработать методики, позволяющие определять присутствие
белков и их синтез.
Электрофорез белков в полиакриламидных гелях (ПААГ) - идеальное средство
для анализа многих сотен генных продуктов любой клетки (см. работы [2-
4]). С помощью этой методики очень удобно следить за изменением в ходе
развития белковых паттернов. Электрофорез дает возможность разделять
белки на основе их дифференциальной подвижности, обусловленной размером
и/или зарядом молекул. В присутствии додецилсульфа-та натрия (ДСН)
электрофорез разделяет белки в соответствии с их молекулярным весом.
Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) обеспечивает разделение на основе
изоэлектрической точки полипептидов, отражающее их аминокислотный состав
и модификацию, например, ацетилирование, гликозилирование и
фосфорилирование. Комбинация этих методик позволяет разделить белки в
соответствии с их характеристиками в двумерном плане. Теоретические
основы и методические подробности использования одномерных и двумерных
гелей представлены в работах [2] и [4].
Выбор стратегии мечения и определения белков с использованием ПААГ
зависит от цели исследования. Одни методики
1 Sarah К. Howlett. AFRC Institute of Animal Physiology and Genetics
Research, Department of Molecular Embryology, Babraham, Cambridge CB2
4AT, UK.
216
Глава 8
R 92#
-S
~
$"?4№ч v#^
¦rn^rn
пригодны для изучения общих или специфических белков, другие позволяют
выявить лишь те белки, которые синтезируются в данное время.
О динамической картине паттерна белков, находящихся в процессе синтеза,
можно судить как по включению меченых аминокислот (они могут быть в виде
смеси или представлены индивидуально, например [35S]-метионин, разд.
2.1.1), так и визуально- при помощи флюорографии (рис. 8.1, 8.2 и 8.3).
Судьбу новосинтезированных меченых белков можно проследить, отмыв клетки
от метки и продолжая инкубировать эмбрион в течение нескольких часов
(эксперименты с импульсным мечением, разд. 2.1.3).
Для ' получения статической картины тотальных белков используют либо
окрашивание серебром немеченых белков в геле (разд. 4.2 и рис. 8.4), либо
иодирование лизированной смеси белков (разд. 2.2) п выявление их методом
радиоавтографии. У раннего эмбриона четко различаются паттерны белков,
синтезированных эмбрионом и запасенных ооцитом (рис. 8.4).
Существует возможность идентифицировать специальные группы белков -
фосфопротеины по включению 32Р (разд. 2.3), гликопротеины по включению
сахаров, меченных 14С или 3Н (разд. 2.4), либо с помощью лектинов. При
наличии специфических антител можно изучать индивидуальные белки. Так,
при помощи антител можно определить присутствие антигена среди белков,
выделенных электрофоретически (иммуноблот-тинг; разд. 4.3), или осадить
меченый антиген из смеси метаболических белков (иммунопреципитация; разд.
2.5).
30
6.
Рис. 8.1. Фосфорилированные белки. Яйца, меченные в первой S-фазе. ("I",
10 ч после осеменения, дорожки а и б); неоплодотворенные яйца ("М", 14 ч
после овуляции, дорожки в и г); меченные соответственно [35S]-метионином
(а и в) или [32Р]-фосфатом (б и г) в течение 1 или 2 ч.
Качественный анализ белков ранних эмбрионов мыши
217
Рис. 8.2. Синтез белка в ходе предимплантационного развития. Одномерный
гель, демонстрирующий1' паттерн белков, меченных [355]-метионшюм, которые
были синтезированы в течение 1-часового импульсного мечення в неопло-
дотворенном яйце (НОЯ), 1-клеточном эмбрионе (1), 2-клеточном (2), 4-
клеточном (4), 8-клеточном (8), 16-клеточном (16), на стадии ранней
кавитации (32) п в поздней бластоцисте (БЛ), Каждая дорожка содержит
материал 10 эмбрионов, за исключением последней, содержащей 6 бластоцист.
В этой главе описаны способы мечения разных классов белков, их разделения
и идентификации. Эти методики универсальны, но, кроме того, их можно
использовать в качестве микрометодов для анализа развивающегося эмбриона.
218
Глава 8
Рис. 8.3. Разделение белков, меченных [355]-метцонином, в двумерном геле.
Двумерный гель демонстрирует паттерн белков, синтезированных в течение 2-
часового периода меченйя первых митозов (18-20 ч после осеменения).
Номера и буквы, обозначающие полипептиды, относятся к эталонным
полипептидам, использованным для локализации (объяснения см. в работах
[15, 39]). Изоэлектрическое фокусирование направлено слева (~рН 7,0)
направо
(~рН 4,5).
2. Мечение белков раннего эмбриона
Мечение синтезирующихся белков (метаболическое мечение) производится
посредством включения радиоактивных аминокислот. Наиболее важное
преимущество радиомечения заключается в том, что методики определения
меченых белков после их разделения в ПААГ характеризуются значительно
более высокой чувствительностью, чем методики окрашивания белков (разд.
4.2). В роли меченой аминокислоты чаще всего выступает [35S]-метионин,
что объясняется его высокой удельной активностью. Важно помнить, однако,
что число остатков метионина в каждом белке будет влиять на интенсивность
