Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
поверхности могут изменяться.
Этот маркер был открыт в результате систематического скрининга,
описанного в разд. 3.3, и применяется против маркера Н-2. Его используют
только в отношении некоторых сосудистых эндотелиев и эпителия кишечника
[8].. Он применяется для изучения эмбрионального развития, начиная с 12-
го дня, и взрослых животных (детали анатомического описания см. в [18,
19, 35]). Выявляемый полиморфизм имеет любопытный реципрокный паттерн у
двух аллелей -Dlb-la и Dlb-lb (табл. 6.7). У мышей Dlb-la сайты
связывания АДБ экспрессируются в эндотелии, но не в кишечном эпителии; у
мышей Dlb-lb распределение обратное.
Маркер АДБ обладает рядом преимуществ. Он исключительно стабилен. Сайты
связывания лектина сохраняют устойчивость при многих процедурах фиксации
(за исключением фиксации в 0,2%-ном глутаральдегиде) и заключения в
парафин или смолу (при условии, что температура не превышает 65 °С).
Обусловленное этим маркером окрашивание -> сильное и чистое; оно идеально
для тотальных препаратов. Процедура окрашивания проста, а удаление
окраски инкубацией в 0,2 М N-ацетилга-лактозамине служит эффективным
контролем специфичности.
Недостатки этого маркера связаны с тем, что он имеется не во всех тканях,
а также с отсутствием положительной окраски для другого компонента
химеры. Экспрессия сайтов связывания АДБ изменяется в диспластических
центрах, индуцированных в эпителии кишечника химическими канцерогенами.
Она имеет пятнистое распределение в эндотелии некоторых капилляров
3.4. Использование в качестве маркера лектина Dolichos (АДБ)
Методы маркирования клеток и их применение
171
и в кишечных криптах, прилегающих к лимфоидным фолликулам. Этот пример
свидетельствует о том, с какой осторожностью следует подходить к оценке
любого нового маркера. Процедура использования лектина Dolichos в
качестве клеточного маркера описана ниже.
3.4.1. Приготовление конъюгвтов АДБ
Конъюгаты АДБ со щелочной фосфатазой, пероксидазой, флуорохромами,
биотином и частицами золота можно приобрести или приготовить стандартными
способами, описанными в оригинальной литературе [30, 31] и в учебных
руководствах. Конъюгацию осуществляйте в присутствии 0,2 М N-ацетилга-
лактозамина для защиты сайтов связывания лектина: впоследствии сахар
может быть удален диализом.
3.4.2. Подготовка тквни для получения срезов
Лучшим фиксатором является метакарн (метанол 60 : инги-бисол 30: ледяная
уксусная кислота 10). Этот фиксатор растворяет пластик, поэтому нужно
пользоваться стеклянной посудой. Фиксируйте ткань в течение ночи и
перенесите в 70%-ный этанол. Можно использовать стандартную заливку в
парафин, но избегать при этом интенсивного нагревания.
3.4.3. Окрашивание срезов
Используйте по возможности свежеприготовленные парафиновые или
криостатные срезы (толщиной 3 мкм), так как при хранении срезов
интенсивность окрашивания уменьшается. Имейте в виду, что флуоресцирующие
конъюгаты на парафиновых срезах дают неудовлетворительные результаты.
Удалите парафин или высушите криостатные срезы и промойте их солевым
раствором с фосфатным буфером (PBS).
1. При окрашивании АДБ, конъюгированным с пероксидазой, сначала
блокируйте эндогенную пероксидазу 0,1%-ным фенилгидразином-HCl в PBS,
затем промывайте 5 мин в PBS, после чего инкубируйте с PBS + 0,5%-Hbifl
БСА в течение 10 мин.
2. Осушите стекла, промокнув PBS + БСА (см. табл. 6.5, п. 12) и прибавьте
конъюгат АДБ, разбавленный PBS + + БСА.
3. Инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре.
4. Промойте, сменив несколько раз PBS, и окрасьте согласно методике,
изложенной в табл. 6.5 (пп. 16 и 17).
172 Глава 6
Методы маркирования клеток и их применение
17S
3.4.4. Контр олн
Чтобы проконтролировать специфичность окрашивания, включите один срез с
конъюгатом АДБ, разведенным в PBS + + БСА до конечной концентрации N-
ацетилгликозамина 0,2 М. Для контроля качества окрашивания включите один
срез стандартной ткани (т. е. слюнной железы мыши линии SWR с
окрашиваемыми капиллярами).
3.4.5. Окрашнввние тотальных препврвтов
Процедура такая же, как и в случае срезов, со следующими модификациями.
1. Фиксируйте приколотую ткань (разд. 6) в 10%-ном солевом формалине
(метакарн будет растворять парафин препаровальной ванночки, кроме того,
он быстро фиксирует н уплотняет ткань, затрудняя удаление слизи).
2. В течение 30 мин блокируйте эндогенную пероксидазу фенилгидразином-
НС1.
3. Промойте тщательно после удаления конъюгата (особенно в случае
кишечного эпителия).
Тотальные препараты химерной ткани представлены на рис. 6.3.
4. Другие маркеры мозаичности
Мозаичность тканей может иметь естественное происхождение (инактивация Х-
хромосомы) или вызываться внешними причинами (индуцированная соматическая
мутация или включенные сегменты ДНК).
Рис. 6.3. Препарат химерной ткани, распределение клеток которой имеет
клональный паттерн. А. Эндотелий аорты химеры C57BL/6J(B6) -"->DDK.
Окрашен АДБ-пероксидазой. Эндотелиальные клетки, происходящие от DDK,
