Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
всегда дающего сильную реакцию.
Оба антитела.
а) если тимус также дает слабую окраску, можно полагать, что произошла
ошибка при фиксации или разбавлении конъюгатов;
б) если тимус окрашен хорошо, возможно, срезы были тоньше, чем обычно,
или неудача связана с особенностями линии мышей (см. выше). Попробуйте
другие срезы или ткани.
2. Неспецифическое окрашивание:
а) в общем, и особенно в отношении соединительной ткани, это указывает иа
"грязный* конъюгат. Попробуйте более высокое разведение;
отцентрифугируйте агрегаты (5 мин в микроцеитрифуге); проведите гель-
фнльтрациоиную хроматографию для очистки фракции с меньшим фоном (в этом
случае вы скорее имеете дело с новым конъюгатом, чем с деградирующим
старым). Если вы полагаете, что этот конъюгат - лучшее, что вы могли
достать, попробуйте другие фиксаторы или сделайте новый конъюгат;
б) специфические сайты. Решить проблему могут различные фиксаторы. Можно
эмпирически попробовать разные "блокирующие" агенты. Обычно ситуация хуже
в отношении одного из конъюгатов, поэтому решение следует искать в
использовании ряда конъюгатов с разной степенью конъюгации и в очистке
гель-фильтрацией. Если это не поможет, попробуйте сменить источник
используемых реактивов (энзим, глутараль-дегид).
3. "Кристаллизация* окраски щелочной фосфатазы при храиеинн срезов. Не
исправить, фотографируйте наиболее важные результаты, пока препараты
свежие.
4. Низкая степень разрешения Н-2-антнгеиов соседних клеток. На уровне
светового микроскопа ситуацию можно улучшить, применив не ферментные, а
флуоресцентные конъюгаты. Возможна и электронная микроскопия с Н-2-
антигеиами [34].
Есть данные о том, что антигены Thy-1 могут отделяться от одних клеток и
захватываться другими, поэтому Thy-1, по крайней мере в некоторых тканях,
нельзя считать маркером, сохраняющим клеточную автономию.
3.3. Полиморфизм углеводов, выявляемый лектинами
По аналогии с полиморфизмом групп крови человека, можно ожидать, что у
мышей существует система полиформизма
Методы маркирования клеток и их применение
169
углеводов, тогда разные полиморфные варианты могут быть использованы в
качестве клеточных маркеров. Пока нашел применение только один из них, он
выявляется агглютинином Do-lichos biftorus (АДБ) [17-19] (рис. 6.2,5),
его использование описано ниже, в разд. 3.4. Учитывая большую потребность
в маркерах, имеет смысл проверять соответствующие ткани мышиных линий на
присутствие нового маркера при помощи набора лектинов, хотя, конечно, эта
работа трудоемка и успех ее ни в коей мере не гарантирован. Ниже
приводится общая схема скрининга для выявления полиморфизма углеводов при
помощи лектинов.
1. Приготовьте набор из 12 (или более) лектинов, конъюгированных с
ферментом или флуоресцирующим маркером, в расчете на перекрывание как
можно большего числа специфических углеводов. Комплекты лектинов для
подобного скрининга имеются в продаже. Если можно, титруйте лектины на
ряде срезов тканей, с которыми они заведомо могут связаться. Ознакомьтесь
с соответствующей литературой. Убедитесь в том, что связывание является
специфическим. Для этого включите контроль, в котором лектиновый конъюгат
разбавлен до конечной концентрации моно- или дисахарида 0,2 М.
2. Приготовьте криостатные срезы соответствующей ткани от как можно
большего числа животных генетически различных линий. Поместите срезы от
трех или более различающихся линий на одно и то же стекло, это облегчит
процедуру окрашивания и сделает более удобным сравнение. Вам понадобится
вдвое большее число стекол по отношению к числу лектинов, которыми вы
располагаете (чтобы иметь специфический контроль, включающий
конкурирующий сахар), плюс несколько запасных. Для первого просмотра
желательно взять нефиксированные срезы; если это вызывает затруднения,
можно использовать слабый фиксатор (солевой раствор с 10% формалина в
течение 1 мин).
3. Инкубируйте лектиновые конъюгаты со срезами в течение 1 ч при
комнатной температуре, промойте и окрасьте фермент. Ищите бесспорные
различия, по принципу "все или ничего".
4. Если различия будут обнаружены, следует выяснить устойчивость окраски
к фиксации и заключению срезов и изучить клеточную автономность
полиморфного варианта как маркера. Эта задача не простая. Если
обнаруженный полиморфизм удовлетворяет выбранным критериям, следует
убедиться в его стабильности при различных физиологических условиях
(возраст эмбриона, а также
170
Глава 6
Таблица 6.7. Распределение аллелей Dlb-1 в линиях мышей
Dlb-1'
Эндотелий+ кише'.иый
DDK, GRS/A, LTS.AF, MAS, SM/Ja, STS, SWR, RIII-ro
Dlb-lb
эпителий - Эндотелий -кишечный + эпителий
AKR, Л/Nimr, BALB/cHeA, C57L, C57BL/6J, C57BL/10ScSn, B.10A, C57BL/KS,
C57BL/Nimr, CBA/Ca, CBA/HN, C3H/Bi, C3H/He, DBA/1, DBA/2, DBA/Af, GE,
HTG, IF, LP/Nimr, LT, NZB, 020/A, SEA/J, SJL/J, 101/H, 129/RrJ
в условиях патологии (например, при неоплазии), если они являются
составной частью эксперимента. Помните, что углеводы клеточной
